一种降解N,N-二甲基甲酰胺的大肠杆菌工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种降解N,N

【技术实现步骤摘要】
一种降解N,N
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二甲基甲酰胺的大肠杆菌工程菌及其应用


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，特别是涉及一种降解N,N
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二甲基甲酰胺的大肠杆菌工程菌及其应用。

技术介绍

[0002]N,N
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二甲基甲酰胺(简称DMF)是一种在自然界中不存在的人工化学品，于1893年首次合成。随后，由于N,N
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二甲基甲酰胺与大多数有机液体和水都具有良好的混溶性，被誉为“万能溶剂”，被广泛应用于各种化学、制造和制药行业。2001年，全球N,N
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二甲基甲酰胺消费量约为285,000公吨，且N,N
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二甲基甲酰胺的需求还以3.5％的速率逐年增加。N,N
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二甲基甲酰胺作为溶剂，在工业生产中被反复回收利用；其作为溶剂在生产和处理过程中几乎无化学消耗，最终成为了废弃物，进入废水。由于N,N
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二甲基甲酰胺的化学结构稳定，难以被普通的生物淤泥降解；因此，相关行业排放的工业废水中仍含有N,N
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二甲基甲酰胺，对环境产生一定危害。
[0003]N,N
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二甲基甲酰胺经口腔、皮肤或吸入接触后很容易被吸收，对人类有肝毒性和致癌性。鉴于N,N
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二甲基甲酰胺的广泛应用和毒性作用的严重程度，从工业废水中降解N,N
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二甲基甲酰胺就显得十分必要。科研工作者探索了从废水中去除N,N
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二甲基甲酰胺的物理和化学方法，包括蒸馏、吸收和吸附。然而，这些物理化学过程不仅不可持续、效率低下，还会产生二次污染。因此，提供一种能够持续、高效地降解N,N
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二甲基甲酰胺，并且不会产生二次污染的新方法是目前亟待解决的问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种降解N,N
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二甲基甲酰胺的大肠杆菌工程菌及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本专利技术利用基因编辑技术，外源基因整合到大肠杆菌基因组，替换原来位置处的内源基因，获得的大肠杆菌工程菌能够表达异源的二甲基甲酰胺酶、二甲胺脱氢酶、甲胺脱氢酶，能以葡萄糖、甘油、木糖、纤维素水解液等常见碳源生长，降解N,N
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二甲基甲酰胺，同时还可以发酵生产琥珀酸。本专利技术为相关行业的N,N
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二甲基甲酰胺废水处理提供了新的方法。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0006]本专利技术提供一种大肠杆菌工程菌，以大肠杆菌为出发菌株经过基因改造导入外源基因，使不具备降解N,N
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二甲基甲酰胺的所述出发菌株能够降解N,N
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二甲基甲酰胺；所述外源基因包括二甲基甲酰胺酶基因DMFase、二甲胺脱氢酶基因DMAase和甲胺脱氢酶基因MAase。
[0007]进一步地，所述二甲基甲酰胺酶基因DMFase的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述二甲胺脱氢酶基因DMAase的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述甲胺脱氢酶基因MAase的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0008]进一步地，所述经过基因改造导入外源基因还包括敲除所述大肠杆菌的内源基
因；所述内源基因包括乙醛酸途径抑制因子基因iclR和琥珀酸脱氢酶基因sdhAB。
[0009]本专利技术还提供一种所述的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括以下步骤：
[0010](1)利用基因编辑技术，将包含二甲基甲酰胺酶基因的载体转入大肠杆菌，替换乙醛酸途径抑制因子基因iclR，构建大肠杆菌一代工程菌株EcEng1
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DMF；
[0011](2)利用基因编辑技术，将包含二甲胺脱氢酶基因的载体转入所述大肠杆菌一代工程菌株EcEng1
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DMF，替换琥珀酸脱氢酶基因sdhAB，构建大肠杆菌二代工程菌株EcEng2
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DMA；
[0012](3)将包含甲胺脱氢酶基因的载体转入所述大肠杆菌二代工程菌株EcEng2
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DMA，构建大肠杆菌三代工程菌株EcEng3
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MA，获得大肠杆菌工程菌。
[0013]进一步地，在步骤(1)中，所述替换乙醛酸途径抑制因子基因iclR具体包括利用如SEQ ID NO.2所示的iclR左同源臂序列和如SEQ ID NO.3所示的iclR右同源臂序列，将包含二甲基甲酰胺酶基因的载体插入到乙醛酸途径抑制因子iclR的位置，同时敲除乙醛酸途径抑制因子iclR。
[0014]进一步地，在步骤(2)中，所述替换琥珀酸脱氢酶基因sdhAB具体包括利用如SEQ ID NO.5所示的sdhAB左同源臂序列和如SEQ ID NO.6所示的sdhAB右同源臂序列，将包含二甲胺脱氢酶基因的载体插入到琥珀酸脱氢酶基因sdhAB的位置，同时敲除琥珀酸脱氢酶基因sdhAB。
[0015]本专利技术还提供一种所述的大肠杆菌工程菌在降解N,N
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二甲基甲酰胺中的应用。
[0016]进一步地，所述大肠杆菌工程菌在降解N,N
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二甲基甲酰胺的同时生产琥珀酸。
[0017]本专利技术还提供一种降解N,N
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二甲基甲酰胺同时生产琥珀酸的方法，将所述的大肠杆菌工程菌或其发酵液投入到含有N,N
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二甲基甲酰胺的液体中，在30
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37℃条件下发酵，降解N,N
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二甲基甲酰胺同时生产琥珀酸。
[0018]进一步地，用于获得所述发酵液的培养基中包括甘油、葡萄糖、木糖或纤维素水解液。
[0019]本专利技术公开了以下技术效果：
[0020]本专利技术以大肠杆菌为出发菌株，利用基因编辑CRISPR/Cas9技术介导的基因敲除及克隆筛选，将来源于嗜氨副球菌Paracoccus aminophilus JCM 7686的二甲基甲酰胺酶基因DMFase、二甲胺脱氢酶基因DMAase和甲胺脱氢酶基因MAase整合到大肠杆菌基因组，同时敲除大肠杆菌乙醛酸途径抑制因子基因iclR和琥珀酸脱氢酶基因sdhAB，以此构建大肠杆菌工程菌。经过基因改造，使改造后的菌株能够表达异源的二甲基甲酰胺酶、二甲胺脱氢酶、甲胺脱氢酶，使原先不具备N,N
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二甲基甲酰胺降解能力的大肠杆菌，改造为可以高效降解N,N
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二甲基甲酰胺的工程菌株。本专利技术获得的工程菌株能以葡萄糖、甘油、木糖、纤维素水解液等常见碳源生长，降解N,N
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二甲基甲酰胺，同时还可以发酵生产琥珀酸。本专利技术为相关行业的N,N
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二甲基甲酰胺废水处理提供了新的方法。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为出发菌株经过基因改造导入外源基因，使不具备降解N,N
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二甲基甲酰胺的所述出发菌株能够降解N,N
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二甲基甲酰胺；所述外源基因包括二甲基甲酰胺酶基因DMFase、二甲胺脱氢酶基因DMAase和甲胺脱氢酶基因MAase。2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述二甲基甲酰胺酶基因DMFase的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述二甲胺脱氢酶基因DMAase的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述甲胺脱氢酶基因MAase的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。3.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述经过基因改造导入外源基因还包括敲除所述大肠杆菌的内源基因；所述内源基因包括乙醛酸途径抑制因子基因iclR和琥珀酸脱氢酶基因sdhAB。4.一种如权利要求1
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3任一项所述的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用基因编辑技术，将包含二甲基甲酰胺酶基因的载体转入大肠杆菌，替换乙醛酸途径抑制因子基因iclR，构建大肠杆菌一代工程菌株EcEng1
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DMF；(2)利用基因编辑技术，将包含二甲胺脱氢酶基因的载体转入所述大肠杆菌一代工程菌株EcEng1
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DMF，替换琥珀酸脱氢酶基因sdhAB，构建大肠杆菌二代工程菌株EcEng2
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DMA；(3)将包含甲胺脱氢酶基因的载体转入所述大肠杆菌二代工程菌株EcEng2
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DMA，构建大肠杆菌三代工程菌株EcEng3<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玮，陈雨蒙，邓最祥，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：