一种油菜的病毒诱导的基因沉默方法技术

本发明专利技术公开了一种油菜的病毒诱导的基因沉默方法，属于生物技术领域。本发明专利技术首先通过PCR扩增获得油菜的基因保守区域BnBADH基因，再与病毒基因表达载体pTRV2连接，得到pTRV2

【技术实现步骤摘要】
一种油菜的病毒诱导的基因沉默方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种研究油菜的基因功能的方法，具体涉及一种油菜的病毒诱导的基因沉默方法。

技术介绍

[0002]病毒诱导的基因沉默(virus
‑
induced gene silencing，VIGS)是植物体中天然存在的一种抵御外源核酸入侵的防御系统，正常情况下保护植物免受病毒的侵染。烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus，TRV)，是一类应用比较广泛而且效率和持久性较好的病毒载体，能够介导基因沉默同时不会带来病毒诱导的症状。TRV1包括编码RNA依赖的RNA聚合酶、运动蛋白和16KD蛋白的基因，是VIGS体系的辅助病毒载体。TRV2包括衣壳蛋白基因、多克隆位点等，用于插入目的基因。改造后的病毒能够促进非病毒序列的插入以及对植物的后续感染，因此TRV在植物基因功能鉴定中具有广泛的应用。
[0003]TRV
‑
VIGS作为一种瞬时基因沉默技术，原理与RNA干扰类似，其主要用来下调目标基因的表达。其技术原理为：将目的基因的片段装载到病毒载体中，然后用构建好的病毒载体侵染植株，从而引起受体植物同源基因沉默的现象。病毒载体刚进入植物体内时，由宿主的RNA聚合酶复制其RNA，形成双链病毒RNA，然后由核酸内切酶识别、切割，形成小的干扰RNA。最后被降解为单链，该单链RNA会特异互补目标基因，形成局部双链RNA结合，并激活植物体内的双链RNA降解机制，从而使宿主植物中的目标基因被降解，即在转录后水平，特异的沉默目标RNA。
[0004]与传统的转基因、基因敲除、反义抑制等基因功能研究方法相比，VIGS技术不需要植物的遗传转化或获取突变体，能简单、快速、瞬时、高效和特异地鉴定基因功能。随着VIGS技术研究地不断发展，该技术已经广泛的应用在不同植物抗性、生长发育以及代谢调控等相关功能基因的研究鉴定上，成为研究植物基因功能的有效技术。
[0005]然而，目前研究油菜基因功能的方法存在耗时长、成本高、操作复杂等弊端，研究开发一种油菜的病毒诱导的基因沉默方法，进而来研究油菜的基因功能的相关研究还未见报道。

技术实现思路

[0006]鉴于此，本专利技术的目的是提供了一种油菜的病毒诱导的基因沉默方法，建立pTRV
‑
VIGS病毒沉默载体系统，通过农杆菌介导对油菜进行侵染，以期望能够简单快速、高通量的研究油菜基因功能。
[0007]本专利技术目的是通过以下方式实现：
[0008]本专利技术提供一种油菜的病毒诱导的基因沉默方法，主要包括以下步骤：
[0009](1)通过PCR扩增获得油菜的基因保守区域BnBADH基因，验证后，进行切胶回收，得到目的基因片段，并对目的基因片段进行加A反应，通过连接酶将得到的目的基因片段与病毒基因表达载体pTRV2进行连接，得到pTRV2
‑
BnBADH表达载体质粒；
[0010](2)制备感受态农杆菌，加入步骤(1)得到的pTRV2
‑
BnBADH表达载体质粒，在液氮中冷冻3
‑
10min，再于35
‑
39℃下静置3
‑
10min后加入LB培养基，于25
‑
30℃摇床培养1
‑
4h，筛选，进行PCR菌落验证，验证正确的菌液留存待用；
[0011](3)将步骤(2)的菌液培养到OD
600
为0.6
‑
0.8之间，将pTRV1与所得的菌液按照体积比为1:2
‑
2:1的比例混合均匀，离心，去上清，在沉淀菌体中加入侵染液并于25
‑
30℃摇床培养2
‑
5h；
[0012](4)将步骤(3)得到的菌液从油菜苗叶片背面于脉络之间注射，期间不可压破叶片，培养一段时间后，检测目的基因的表达情况。
[0013]基于上述技术方案，进一步的，步骤(1)中所述的PCR扩增条件为：94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃15s，72℃10min。
[0014]基于上述技术方案，进一步的，步骤(1)中PCR扩增的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1
‑
2所示。
[0015]基于上述技术方案，进一步的，步骤(1)中切胶回收的具体过程为：于装有胶块的EP管中加入600μL溶胶Buffer，待胶块融化将其加入吸附柱中静置3min后，于离心机中12000rpm下离心1min，再加入到吸附柱中，12000rpm下离心1min，倒离心液并加入600μL的Washing Buffer，静置3min后离心1min，将吸附柱换至1.5mL EP管，加50μL的ddH2O将DNA洗脱下来，洗脱液于真空旋干仪上旋干20min，即得。
[0016]基于上述技术方案，进一步的，步骤(1)中加A反应的条件为：72℃60min，65℃10min。
[0017]基于上述技术方案，进一步的，步骤(1)中的连接酶为T4连接酶。
[0018]基于上述技术方案，进一步的，步骤(2)中农杆菌具体为农杆菌GV3101。
[0019]基于上述技术方案，进一步的，步骤(2)中感受态农杆菌的制备过程具体为：将农杆菌接种于LB培养基中，并于28℃摇床中过夜培养活化，从活化农杆菌中吸取500μL菌液于50mL含抗生素的LB培养基中，其中庆大霉素40μg/mL、利福平20μg/mL，在28℃摇床培养到OD
600
约0.8，将菌液4000rpm离心10min，去上清，加60mM的CaCl2溶液10mL并混匀，再离心10min，去上清，加1mL 60mM的CaCl2溶液和100μL的二甲基亚砜，混匀制成感受态农杆菌。
[0020]基于上述技术方案，进一步的，步骤(3)中离心的条件为4℃下，3000
‑
5000rpm离心3
‑
10min。
[0021]基于上述技术方案，进一步的，步骤(3)中侵染液制备过程为：在100mL去离子水中依次加入0.205g的MgCl2、0.4275g的MES、100μL的200mmol乙酰丁香酮，调节pH至5.7
‑
5.8之间，加20μL表面活性剂，搅拌均匀，即得。
[0022]基于上述技术方案，进一步的，步骤(4)中培养的条件为：在25℃下，光照15小时、黑暗9小时，培养7
‑
14d。
[0023]本专利技术相对于现有技术具有的有益效果如下：
[0024]1.病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术在植物上直接产生RNA干扰效果，大幅度节约时间和成本，VIGS不受载体上的启动子等基因元件的限制，可同时沉默多个基因。
[0025]2.本方法避免了传统转基因体系研究的弊端，尤其适合转化体系不成熟的植物和受基因型限制的品种，因而可广泛用以油菜的基因功能研究。
[0026]3.本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种油菜的病毒诱导的基因沉默方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)通过PCR扩增获得油菜的基因保守区域BnBADH基因，验证后，进行切胶回收，得到目的基因片段，并对目的基因片段进行加A反应，通过连接酶将得到的目的基因片段与病毒基因表达载体pTRV2进行连接，得到pTRV2
‑
BnBADH表达载体质粒；(2)制备感受态农杆菌，加入步骤(1)得到的pTRV2
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BnBADH表达载体质粒，在液氮中冷冻3
‑
10min，再于35
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39℃下静置3
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10min后加入LB培养基，于25
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30℃摇床培养1
‑
4h，筛选，进行PCR菌落验证，验证正确的菌液留存待用；(3)将步骤(2)的菌液培养到OD
600
为0.6
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0.8之间，将pTRV1与所得的菌液按照体积比为1:2
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2:1的比例混合均匀，离心，去上清，在沉淀菌体中加入侵染液并于25
‑
30℃摇床培养2
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5h；(4)将步骤(3)得到的菌液从油菜苗叶片背面于脉络之间注射，期间不可压破叶片，培养一段时间后，检测目的基因的表达情况。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的PCR扩增条件为：94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃15s，72℃10min。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中PCR扩增的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1
‑
2所示。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中切胶回收的具体过程为：于装有胶块的EP管中加入600μL溶胶Buffer，待胶块融化将其加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志文，杨明煊，王晨晨，李芙蓉，于放，张悦，高潇潇，金朝霞，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：