米诺地尔在制备治疗肿瘤的药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了米诺地尔在制备治疗肿瘤的药物中的应用。本发明专利技术首先使用了B16F10黑色素瘤细胞系，通过对C57BL/6J小鼠尾静脉植瘤方式构建了B16小鼠转移模型。以尾静脉方式将扩血管药物米诺地尔注射到小鼠体内，通过肺组织肿瘤定植点计数，检测出米诺地尔可以抑制肿瘤定植。其次对黑色素瘤转移模型鼠肺组织进行血红蛋白测定，发现治疗组的肺组织血红蛋白含量增加，血供增强。通过流式细胞术对黑色素瘤转移模型鼠的肺组织T细胞含量进行测定，发现经过药物调节小鼠肺组织内T细胞浸润增加。药物调节小鼠肺组织内T细胞浸润增加。药物调节小鼠肺组织内T细胞浸润增加。

【技术实现步骤摘要】
米诺地尔在制备治疗肿瘤的药物中的应用


[0001]本专利技术属于医药
，具体涉及米诺地尔在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

技术介绍

[0002]黑色素瘤是由异常黑素细胞过度增生引发的常见的皮肤肿瘤，恶性程度极高，占皮肤肿瘤死亡病例的极大部分。该肿瘤扩散迅速，可在诊断数月后死亡。目前外科手术治是大部分皮肤黑色素瘤的首选治疗，化疗、放疗、激光治疗、靶向治疗仍然是黑色素瘤治疗的重要组成部分。由于恶性黑色素瘤晚期，伴有淋巴转移、骨转移、脑转移等，无法进行手术治疗，只能通过放疗、化疗等手段延长生命。
[0003]米诺地尔，化学式6
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2,4
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嘧啶二胺,3
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氧化物，呈白色或类白色结晶性粉末。临床上作为钾离子通道开放剂，能直接松弛血管平滑肌，有强大的小动脉扩张作用，用于顽固性、原发性或肾性高血压，也用于预防油脂性脱发。有文章报道过细胞实验和动物实验都有报道米诺地尔能够诱导毛乳头细胞促进VEGF增加，促进血管增多，增强循环血量。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供了米诺地尔在制备治疗肿瘤的药物中的应用。其中米诺地尔的化学名为6
‑‑
2,4
‑
嘧啶二胺,3
‑
氧化物，其化学结构式如下：
[0005][0006]其中所述肿瘤为黑色素瘤。
[0007]米诺地尔药物可以作用于全身血管，促进全身血管的生成，增强循环血量，通过增加血供，促进了受累组织内T细胞的浸润，产生抑制肿瘤生长的作用。
[0008]本专利技术首先使用了B16F10黑色素瘤细胞系，通过对C57BL/6J小鼠尾静脉植瘤方式构建了B16小鼠转移模型。以尾静脉方式将扩血管药物米诺地尔注射到小鼠体内，通过肺组织肿瘤定植点计数，检测出米诺地尔可以抑制肿瘤定植。其次对黑色素瘤转移模型鼠肺组织进行血红蛋白测定，发现治疗组的肺组织血红蛋白含量增加，血供增强。通过流式细胞术对黑色素瘤转移模型鼠的肺组织T细胞含量进行测定，发现经过药物调节小鼠肺组织内T细胞浸润增加。
[0009]说明书附图
[0010]图1、微量游离血红蛋白测定图。
[0011]图2、肿瘤内T细胞含量测定图。
[0012]图3、对照组与治疗组肿瘤定植点拍照与数量计数，其中A为黑色素瘤转移模型的右肺的外观照片，B为肿瘤定植点数量计数图。
[0013]图4、对照组与治疗组苏木精
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伊红染色下定植情况比对照片。
具体实施方式
[0014]下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但实施例的描述不对本专利技术的保护范围产生任何限制。
[0015]除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在限制本专利技术。
[0016]下列实施例中所用的物质或仪器，如果未进行特殊说明的话，均可以从常规的商用渠道获取。
[0017]实施例1黑色素瘤B16动物模型的构建
[0018]1、黑色素瘤B16F10细胞的培养
[0019]将购买自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的B16F10黑色素瘤细胞冻存管，快速在37℃水浴锅解冻1min，在10ml离心管加入2ml的DMEM培液，将细胞冻存液加入10ml的离心管，离心800rpm、5min。离心后弃上清液，离心管加2mlDMEM培液，先向培养皿中加9ml培液，再向每个培养皿加入1ml离心后的细胞液，十字摇晃均匀。放入37℃、5％CO2培养箱中培养。
[0020]2、黑色素转移模型构建
[0021]从江苏集萃药康生物股份有限公司购得6
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8周龄，体重20
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25克的正常雌性C57BL/6J小鼠，将小鼠随机分为3组不同梯度药物治疗组和1组对照组饲养，每组6只。小鼠在开始造模前适应环境至少三天，饮用正常无菌水。
[0022]待B16F10细胞长满10cm培养皿，用1
×
PBS重悬细胞，重悬至细胞密度为5
×
105个/200μl。
[0023]提前给药调节小鼠生理状态，对照组采用尾静脉注射1
×
PBS，100μl，持续给药5天，治疗组给予浓度0.1mg/kg、1mg/kg、10mg/kg的米诺地尔，每只给药100μl，持续给药5天。待给药第五天时，对小鼠尾静脉植瘤，每只小鼠植瘤密度5
×
105个，植瘤10天。实验组每天保持米诺地尔给药持续至植瘤后第十天收样，对照组每天保持PBS给药持续至植瘤后第十天收样。
[0024]实施例2采用检测小鼠肺组织中血红蛋白含量计算小鼠肺部组织循环血量变化
[0025]对小鼠对照组与治疗组手术，首先打开小鼠胸腔后先结扎小鼠的左侧肺叶，接着用1
×
PBS灌注，至小鼠右侧肺叶上呈白色时停止。收取肺组织，将左侧肺叶至于1.5ml EP管中，右侧肺叶拍照计数。
[0026]将收取的左侧肺组织，称量肺组织重量，加5倍重量的PBS溶液，用组织匀浆机60HZ，60秒2次，将其打碎。吸取500μl肺组织匀浆液到1.5ml的EP管中，向其中加500μl红细胞裂解液，用枪吹打均匀后，至于冰盒上静置5分钟。在12000rpm条件下，离心20分钟。根据购买自南京建成生物工程研究所的微量游离血红蛋白测试盒，根据实验动物数量，每只小鼠配2.5ml显色液。从离心后的EP管中，用PBS稀释合理倍数后，吸取15μl上清液，加到2.5ml显色液中，
[0027]同时准备空白对照管，将15μl的PBS加到2.5ml显色液中。混匀，将EP管至于37度水浴锅中，加热20分钟。在紫外分光光度计下检测OD值，通过空白管调零，λ＝510nm，1cm光径。
[0028]微量游离血红蛋白计算公式：
[0029]游离血红蛋白(mg/L)＝126.0
×
(测定OD值
‑
空白OD值)+3.5041。
[0030]图1显示的是，根据本专利技术实施例造出的黑色素瘤转移模型的左肺血红蛋白含量的检测。
[0031]图1的结果显示相对于PBS对照组，药物米诺地尔增加了肺组织组织中的循环血量，并且给药剂量为10mg/kg的米诺地尔增加循环血量的效果优于0.1mg/kg、1mg/kg。
[0032]实施例3肺组织内浸润T细胞的数量
[0033]对照组与治疗组小鼠在持续给药5天后，通过尾静脉注射5x105个B16黑色素瘤细胞，激活小鼠体内免疫反应，尾静脉植瘤后2天，收样检测肺组织内T细胞浸润情况。
[0034]先通过PBS灌注肺组织，再通过手术，剥离出治疗组和对照组肺组织，将肺组织剪碎，剪碎消化后，制备成单细胞悬液，加入10％的血清终止消化。用70μm筛网去除组织碎片，用1
×
HBSS将筛网冲洗干净，将细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.米诺地尔在制备治疗肿瘤的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述肿瘤为黑色素瘤。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于治疗是通过促进机体血管...

【专利技术属性】
技术研发人员：董磊，吴继松，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：