一种MTHFRC677T基因多态性分型检测方法技术

本发明专利技术利用RPA

【技术实现步骤摘要】
一种MTHFR C677T基因多态性分型检测方法


[0001]本专利技术属于基因多态性检测
，具体是指一种MTHFR C677T基因多态性分型检测方法。

技术介绍

[0002]叶酸，又称维生素B9。叶酸在DNA合成、DNA甲基化等方面发挥重要的作用，与胚胎正常发育、健康维持以及多种疾病的风险有关，是细胞增殖、组织生长与机体发育不可缺少的营养素。一旦机体发生叶酸缺陷或者叶酸代谢酶的缺陷，就会导致细胞周期不正常，DNA、蛋白质甲基化反应异常、DNA碱基无法正常合成等多种生化反应异常，从而直接或间接地导致新生儿或胎儿神经管缺陷以及成年人的癌症、心血管疾病的发生。
[0003]目前，经验证MTHFR(亚甲基四氢叶酸还原酶)是与叶酸代谢密切相关的基因，主要作用是在叶酸代谢通路中将5,10
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亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5
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甲基四氢叶酸，甲基化后的叶酸具有生物活性，可以被人体使用。该酶是人体叶酸代谢中的一个十分重要的酶。因此，MTHFR基因一旦发生缺陷，将导致机体多个基础生化过程(包括细胞周期调控、DNA复制、DNA以及蛋白质甲基化修饰等)的紊乱，进而引发神经管缺陷、癌症、心脑血管疾病等多种病症。
[0004]在精准医疗时代，单核苷酸多态性(SNP)分型是诊断各种病理的有价值的工具。MTHFR基因多态性分型是叶酸代谢相关疾病精准医疗的基础。目前，有关SNP分型的技术有很多种，包括直接测序法、限制性片段长度多态性分析法、荧光定量PCR技术(qPCR)、分子信标等技术。然而，这些方法都有一定的局限性，如假阳性率高、耗时费力和对样本要求高等问题。另外，临床常用的MTHFR基因多态性分型方法是PCR
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荧光探针法，其检测限为200copies/μL，灵敏度不足，且对样本要求较高。因此需建立一种灵敏度高的MTHFR基因多态性分型检测方法。连接酶链反应(LDR)是近年来开发出的一种基于高温连接酶检测基因分型的新方法。海洋嗜热菌Thermus aquaticus高温连接酶一旦检测到DNA与互补的2条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配，则连接反应就不能进行，反之则可以进行连接反应。重组酶聚合酶扩增(RPA)技术较PCR技术具有更快速简便的优点。本专利技术为临床检测相关单碱基突变提供一种新的快速、高效、特异性的分子诊断方法，应用于MTHFR基因多态性分型。

技术实现思路

[0005]本专利技术利用RPA
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LDR
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qPCR技术，用于MTHFR C677T基因多态性分型检测。
[0006]本专利技术提供一种MTHFR C677T基因多态性分型检测方法，包括以下步骤：
[0007](1)利用特异性扩增引物1和引物2，使用RPA反应体系扩增该位点的野生型片段或突变型片段；
[0008](2)利用特异性扩增引物3、4和5，使用LDR反应体系对步骤(1)扩增产物进行处理；
[0009](3)利用特异性扩增引物6和7，使用qPCR反应体系对步骤骤(2)的反应产物判别基
因分型结果；
[0010]在一些实施方案中，步骤(1)所述引物序列如下：
[0011]引物1：CTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAAGGT；
[0012]引物2：TGCCCATGTCGGTGCATGCCTTCAC。
[0013]在一些实施方案中，步骤(2)所述引物序列如下：
[0014]引物3：CGGTTTTGGCGCAGTGACGCTGCGTGATGATGAAATCGG；
[0015]引物4：CGGTTTTGGCGCAGTGACGCTGCGTGATGATGAAATCGA；
[0016]引物5：PHO
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CTCCCGCAGACACCTTCTCCAGATAGCCAACCCGAGCGCCT。
[0017]在一些实施方案中，步骤(3)所述引物序列如下：
[0018]引物6：CGGTTTTGGCGCAGTGACG；
[0019]引物7：AGGCGCTCGGGTTGGCTATCT。
[0020]在一些实施方案中，步骤(1)RPA反应体系中，包括以下组分，1μL模板，引物1(10μM)和引物2(10μM)各2.4μL，以及补液缓冲液29.5μL、RNase抑制剂和dH2O 13.2μL，所述模板为提取的患者DNA。
[0021]在一些实施方案中，步骤(1)RPA反应程序为：添加2.5μL浓度为280mM乙酸镁启动反应，并在37℃孵育30min。
[0022]在一些实施方案中，步骤(2)LDR反应体系，包括以下组分，20nM引物3或20nM引物4 1μL，20nM Probe
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PHO 1μL，10
×
Taq DNA Ligase Buffer 1μL,Taq DNA Ligase(40U/μL)1μL，RPA扩增产物1μL，超纯水5μL。
[0023]在一些实施方案中，步骤(2)LDR反应程序为：混合反应物瞬时离心后，先在95℃变性3min后，接着在60℃延伸1min。
[0024]在一些实施方案中，步骤(3)qPCR反应体系，包括以下组分，MonAmp
TM ChemoHS qPCR Mix 10μL，引物6 0.4μL，引物7 0.4μL，Low ROX Dye(100
×
)0.2μL，超纯水8μL，LDR反应产物为模版1μL，。
[0025]在一些实施方案中，步骤(3)qPCR反应程序为：预变性95℃10min；变性95℃10s，退火和延伸60℃30s，反应40个循环。
[0026]本专利技术的具体原理是：利用RPA反应对样品DNA进行扩增，利用RPA反应对特定DNA序列进行扩增，从而产生不同DNA间量的差异，利用qPCR反应进一步放大该量的差异并进行定量定性分析，从而得出基因分型结论。
[0027]本专利技术的有益效果：将RPA检测技术代替PCR技术，使检测时间大大缩短，且不使用昂贵的PCR仪，在常温条件下即可实现核酸扩增。
[0028]以RPA
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LDR
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qPCR技术作为MTHFR C677T基因多态性分型检测具有高灵敏度、特异性强等优点。
附图说明
[0029]图1RPA
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LDR
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qPCR方法的可行性对三种不同基因型进行分型检测，其中CC为野生纯合型；CT为突变杂合型；TT为突变纯合型。
[0030]图2RPA
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LDR
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qPCR灵敏度检测(A)样品浓度为103,102,101,和100copies/μL检测CC(A)、CT(B)和TT(C)多态性的qPCR步骤的荧光曲线。
具体实施方案
[0031]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种MTHFR C677T基因多态性分型检测方法，包括以下步骤：(1)利用特异性扩增引物1和引物2，使用RPA反应体系扩增该位点的野生型片段或突变型片段；(2)利用特异性扩增引物3、4和5，使用LDR反应体系对步骤(1)扩增产物进行处理；(3)利用特异性扩增引物6和7，使用qPCR反应体系对步骤(2)的反应产物判别基因分型结果。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述引物序列如下：引物1：CTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAAGGT；引物2：TGCCCATGTCGGTGCATGCCTTCAC。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述引物序列如下：引物3：CGGTTTTGGCGCAGTGACGCTGCGTGATGATGAAATCGG；引物4：CGGTTTTGGCGCAGTGACGCTGCGTGATGATGAAATCGA；引物5：PHO
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CTCCCGCAGACACCTTCTCCAGATAGCCAACCCGAGCGCCT。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)所述引物序列如下：引物6：CGGTTTTGGCGCAGTGACG；引物7：AGGCGCTCGGGTTGGCTATCT。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)RPA反应体系中，包括以下组分，1μL模板，引物1(10μM)和引物2(10μM)各2.4μL，以及补液缓冲液...

【专利技术属性】
技术研发人员：司鑫鑫，谷庆花，高嵩，赵陈洁，张晓，肖婷婷，应葳，
申请(专利权)人：江苏海洋大学，
类型：发明
国别省市：