利用海洋拟诺卡氏菌NA01583生产隆纳霉素的培养基及其发酵生产隆纳霉素的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用海洋拟诺卡氏菌NA01583生产隆纳霉素的发酵培养基，每升发酵培养基包括如下组分：葡萄糖20

【技术实现步骤摘要】
利用海洋拟诺卡氏菌NA01583生产隆纳霉素的培养基及其发酵生产隆纳霉素的方法


[0001]本专利技术属于微生物发酵培养基
，具体地说，是涉及培养海洋拟诺卡氏菌NA01583的培养基的
，更具体地说，是关于一种利用海洋拟诺卡氏菌NA01583生产隆纳霉素的培养基及其发酵生产隆纳霉素的方法。

技术介绍

[0002]细菌、真菌和病毒感染造成的疾病依旧是人类公共卫生健康的主要威胁，而新型有效药物的缺乏和抗药性微生物的存在进一步加剧了这种状况。随着微生物培养、样品采集和光谱分析等技术的发展，新药的研发逐渐将目光投向海洋。海洋约占据地球表面积的70％，是极其珍贵的生物多样性宝库，其极端的环境造就了许多独特生物，产生多种结构新颖的化合物。自2008年以来，每年均有1000多种海洋天然产物被发现，并且该数目呈逐年递增趋势，2018年新发现的海洋天然产物有1554种。
[0003]目前，经FDA批准上市的海洋来源药物为Cytarabine(1969)、Vidarabine(1976)、Ziconotide(2004)、Omega
‑3‑
acid ethyl esters(2004)、Eicosapenta enoic acid ethyl ester(2012)、Omega
‑3‑
carboxylic acid(2014)、Eribulin mesylate(2010)、Brentuximab vedotin(2011)、Trabectedin(2015)、Panobinostat(2015)、Plitidepsin(2018)、Polatuzumab vedotin(2019)、Enfortumab vedotin(2019)、Lurbinectedin(2020)、Belantamab mafodotin(2020)、Disitamab vedotin(2021)，此外还有多种海洋生物来源的生物活性物质正处于临床前研究阶段。海洋微生物来源的天然产物及其结构类似物已经成为近些年来新型药物开发的重要来源，应用前景广阔。
[0004]隆纳霉素(Loonamycin)是由南京大学戈惠民课题组从中国南海泥中分离得到的一株拟诺卡氏菌NA01583中分离得到的一种蝴蝶霉素结构类似物，研究表明其对多种肿瘤细胞株的增殖具有抑制作用。薛佳兴等研究表明，隆纳霉素通过和DNA
‑
拓扑异构酶Ⅰ相互作用导致细胞周期阻滞，抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖。
[0005]新型天然产物往往产量极低，而药物的研发都需要充足的原料药供应，这对于海洋来源的药物极为困难，许多海洋药物的研发需要通过发酵优化、规模化放大等手段解决原料药制备的问题。因此，有必要通过改善其发酵条件来提高隆纳霉素的产量。
[0006]另外，传统发酵优化常采用单因素试验策略，针对碳源、氮源、接种量、pH等条件进行初步优化，但该策略无法对各因素之间的相互作用进行分析。因此利用现有的方法发酵得到的隆纳霉素的产量不高，生产效率低。因此有必要通过优化培养基方案和/或发酵方法来提高海洋拟诺卡氏菌NA01583生产隆纳霉素。

技术实现思路

[0007]本专利技术针对以上现状，拟从初始M8培养基的基础上，采用单因素试验和响应面试验，对隆纳霉素发酵培养条件进行优化，确定最佳发酵工艺以提高隆纳霉素产量，并在5L反
应器规模进行放大，为隆纳霉素后续药物实验确保充足的原料药供应，同时为其他海洋来源天然产物的发酵优化提供借鉴依据。为此，本专利技术通过响应面法优化发酵培养基，确定了最佳培养基组分和摇瓶最佳培养条件。其中，最佳培养基组分为葡萄糖20g/L、黄豆粉11g/L、蛋白胨3g/L、酵母粉5g/L、NaCl 1.6g/L、CaCO
3 2g/L，摇瓶最佳培养条件为装液量10％、初始pH值7.0、接种量1％、种龄24h、培养温度28℃。在该摇瓶发酵工艺下，拟诺卡氏菌NA01583发酵液中隆纳霉素含量达到(602.32
±
96.20)mg/L，是优化前的5.57倍。采用最佳培养基在5L生物反应器中放大，隆纳霉素产量达到848.88mg/L。因此，本专利技术的第一个目的是提供一种利用海洋拟诺卡氏菌NA01583生产隆纳霉素的发酵培养基。本专利技术的第二个目的是一种使用上述所述的发酵培养基发酵生产隆纳霉素的发酵方法。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]作为本专利技术的第一个方面，一种利用海洋拟诺卡氏菌NA01583生产隆纳霉素的发酵培养基，每升发酵培养基包括如下组分：
[0010]葡萄糖20
‑
30g/L、蛋白胨0.49
‑
3.01g/L、酵母粉5.0
‑
7.5g/L、黄豆粉0.95
‑
11.05g/L、氯化钠0.97
‑
6.02g/L、碳酸钙2
‑
3g/L，pH值6～8，采用去离子水配制培养基。
[0011]优选的，每升发酵培养基包括如下组分：葡萄糖20g/L、蛋白胨3g/L、酵母粉5g/L、黄豆粉11g/L、氯化钠1.6g/L、碳酸钙2g/L，pH值7.0。
[0012]作为本专利技术的第二个方面，一种使用上述所述的发酵培养基发酵生产隆纳霉素的发酵方法，其是将拟诺卡氏菌NA01583种子液接种于上述所述的发酵培养基中进行发酵，获得隆纳霉素。
[0013]根据本专利技术，发酵培养条件为：装液量10
‑
20％；初始pH值6
‑
7；接种量0.5
‑
5％；种龄24
‑
48h；培养温度28
‑
32℃。
[0014]优选的，发酵培养条件为：装液量10％；初始pH值7.0；接种量1％；种龄24h；培养温度28℃。
[0015]根据本专利技术，拟诺卡氏菌NA01583种子液的制备步骤包括：
[0016]步骤一、将拟诺卡氏菌NA01583接种到ISP2固体培养基上活化，于28℃条件下培养4d；
[0017]步骤二、将1
×
1cm2琼脂块接种于0级种子培养基中，于28℃，200r/min摇床培养24h；
[0018]步骤三、取1OD培养24h的0级种子液接种于1级种子培养基中，于28℃，200r/min摇床培养24h，制备获得拟诺卡氏菌NA01583种子液。
[0019]根据本专利技术，所述0级种子培养基和1级种子培养基均为：TSB培养基干粉30g/L，pH自然，摇瓶装液量为25/250mL(装液量/摇瓶规格)。
[0020]作为本专利技术的第三个方面，一种使用上述所述的发酵培养基大规模发酵生产隆纳霉素的发酵方法，其是将拟诺卡氏菌NA01583种子液接种于上述所述的发酵培养基中，然后在5L生物反应器中进行规模化发酵，获得隆纳霉素。
[0021]根据本专利技术，规模化发酵的培养条件包括：装液量60％；初始pH值7.0；接种量1％；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用海洋拟诺卡氏菌NA01583生产隆纳霉素的发酵培养基，其特征在于，每升发酵培养基包括如下组分：葡萄糖20
‑
30g/L、蛋白胨0.49
‑
3.01g/L、酵母粉5.0
‑
7.5g/L、黄豆粉0.95
‑
11.05g/L、氯化钠0.97
‑
6.02g/L、碳酸钙2
‑
3g/L，pH值6～8，采用去离子水配制培养基。2.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，每升发酵培养基包括如下组分：葡萄糖20g/L、蛋白胨3g/L、酵母粉5g/L、黄豆粉11g/L、氯化钠1.6g/L、碳酸钙2g/L，pH值7.0。3.一种使用权利要求1或2所述的发酵培养基发酵生产隆纳霉素的发酵方法，其特征在于，其是将拟诺卡氏菌NA01583种子液接种于权利要求1或2所述的发酵培养基中进行发酵，获得隆纳霉素。4.如权利要求3的所述的发酵方法，其特征在于，发酵培养条件为：装液量10
‑
20％；初始pH值6
‑
7；接种量0.5
‑
5％；种龄24
‑
48h；培养温度28
‑
32℃。5.如权利要求4的所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养条件为：装液量10％；初始pH值7.0；接种量1％；种龄24h；培养温度28℃。6.如权利要求3
‑
5任一项所述的发酵方法，其特征在于，拟诺卡氏菌NA01583种子液的制备步骤包括：步骤一、将拟诺卡氏菌NA01583接...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴海珍，叶江，张恵展，曹源，王瑞达，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：