SlSR3基因作为负调控因子在提高番茄脐腐病抗性中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及SlSR3基因作为负调控因子在提高番茄脐腐病抗性中的应用，所述的SlSR3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，本发明专利技术利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得番茄SlSR3基因敲除的突变体，通过观察纯合突变体番茄植株表型、分析突变体的钙含量，发现SlSR3基因能够增加番茄对脐腐病的抗性，而敲除SlSR3基因则会使番茄易感脐腐病，可用于抗番茄脐腐病品种的选育。用于抗番茄脐腐病品种的选育。用于抗番茄脐腐病品种的选育。

【技术实现步骤摘要】
SlSR3基因作为负调控因子在提高番茄脐腐病抗性中的应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及SlSR3基因作为负调控因子在提高番茄脐腐病抗性中的应用。

技术介绍

[0002]番茄(SolanumlycopersicumL.)系茄科茄属番茄亚属，作为中国设施栽培面积最大的蔬菜作物，是最受欢迎的蔬菜之一。随着生活水平的提高，人们对于番茄的产量、品质、口感、色泽等指标要求越来越高。而实现高产优质的番茄途径之一就是培育优良的株型，减少病害的发生。番茄脐腐病是番茄栽培中常见的生理病害，能够对番茄果实的产量和品质造成严重影响。目前关于番茄脐腐病发生的研究主要集中在土壤盐分、温度、湿度等外界环境因素，而相关的分子机理仍需进一步探索。
[0003]目前，防治番茄脐腐病主要通过施肥或者是施药，例如，专利技术专利CN112250515A公开了一种防治番茄脐腐病的微生物复合肥及其制备方法，微生物复合肥包括如下组成成分：三元素菌肥、保水剂和防害剂，将三元素肥、圆褐固氮菌、巨大芽孢杆菌和硅酸盐细菌混合；通过多重的肥料设置逐渐增强番茄根株的健康，能够有效的防治番茄脐腐病。专利技术专利CN105859404A公开了一种番茄脐腐病防治专用喷施肥，该喷施肥由蛋壳55
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70％、氧化铁10
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20％、白醋20
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30％组成。但是，目前并没有公开番茄脐腐病相关的基因研究。因此，亟待研究减少番茄脐腐病发生，培育抗脐腐病株型，从而为番茄优产高产提供基础保障。
[0004]脐腐病最初发生在番茄的第一和第二穗果上，发病初期在果实的脐部呈现褐色水渍状的病斑。后期随着番茄果实的膨大，病斑逐渐扩展，最终使果实失去商品价值。Ca
2+
作为信号分子对于植物的生长发育具有重要的作用，当植物受到外界胁迫时，细胞内的Ca
2+
水平会发生变化。钙信号受体钙调素(CaM)、钙依赖蛋白激酶(CDPK)、钙调磷酸酶B类蛋白等大量的存在于细胞质中参与Ca
2+
信号转导过程，从而调控番茄应激反应。大部分学者认为番茄脐腐病主要是由于生殖生长期番茄局部Ca
2+
分配不均导致其发生，也有一些学者认为干旱、高温、强光、盐度等非生物胁迫也是造成脐腐病的重要因素。除此之外，也有一些研究者认为番茄脐腐病的发生和Ca
2+
并没有直接的联系。
[0005]综上所述，目前关于脐腐病进行了广泛的研究，但其发病机理一直处于假说阶段，相关的遗传学证据仍需进一步探索。近年来生物技术的发展为通过基因编辑进而抑制脐腐病的发生提供了可能，因此培育番茄抗脐腐病的株系在研究脐腐病发生机理、栽培及育种等方面具有重要的研究意义和应用价值。

技术实现思路

[0006]为了解决存在的问题，本专利技术提供了钙调蛋白SlSR3基因负调控番茄脐腐病发生的新用途，丰富了番茄脐腐病发生的分子调控理论，为未来培育抗番茄脐腐病的番茄品种提供新的依据。具体技术方案如下：
[0007]本专利技术的首要目的是提供了一种负调控因子SlSR3基因在提高植物脐腐病抗性上
的应用，所述的SlSR3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0008]本专利技术的第二目的是提供一种由负调控因子SlSR3基因编码的蛋白在提高植物脐腐病抗性上的应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0009]优选的，所述的植物为番茄。
[0010]优选的，所述的负调控因子SlSR3基因具体表现为SlSR3基因敲除后，降低了番茄幼苗的株高。
[0011]优选的，所述的负调控因子SlSR3基因具体表现为SlSR3基因敲除后，加剧了番茄的落花落果。
[0012]优选的，所述的负调控因子SlSR3基因具体表现为SlSR3基因敲除后，降低植株中钙离子的含量。
[0013]本专利技术的第三目的是提供一种构建敲除SlSR3基因的突变体株系的方法，包括以下步骤：
[0014](1)设计SlSR3基因的靶序列sgRNA1，构建CRISPR/Cas9载体；所述靶序列sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0015](2)构建含步骤(1)所述番茄SlSR3基因编辑的CRISPR/Cas9载体；
[0016](3)将上述载体转入农杆菌感受态细胞中，获得CRISPR/Cas9载体的农杆菌；
[0017](4)将步骤(3)所述农杆菌转化番茄子叶，通过组织培养，获得SlSR3基因缺失且稳定遗传的纯合突变体株系。
[0018]优选的，所述农杆菌感受态为GV3101。
[0019]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0020](1)本专利技术利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得番茄SlSR3基因敲除的突变体，通过观察纯合突变体番茄植株表型、分析突变体的钙含量，发现SlSR3基因能够增加番茄对脐腐病的抗性，而敲除SlSR3基因则会使番茄易感脐腐病，可用于抗番茄脐腐病品种的选育。
[0021](2)本专利技术利用基因编辑技术，有助于深入理解钙调蛋白基因家族SR3基因调控脐腐病的功能，从遗传学方面深入了解番茄脐腐病发生机理，进一步结合选育也可为脐腐病抗性加强型番茄种质的培育提供新途径。
附图说明
[0022]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分。
[0023]图1为实施例1中SlSR3基因敲除突变体在番茄生长发育过程中的表型
[0024]图2为实施例1中SlSR3基因敲除突变体在番茄果实发育过程中的脐腐病发生的表型
[0025]图3为实施例1中SlSR3基因敲除突变体检测结果，其中，SlSR3基因的纯合子株系缺少1bp碱基。
具体实施方式
[0026]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步描述，以下列举的仅是本专利技术的具体实施例，但本专利技术的保护范围不仅限于此。
[0027]实施例1利用CRISPR/Cas9技术获得SlSR3敲除突变体slsr3
[0028]1、SlSR3基因CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建
[0029]从网站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中搜索获得番茄钙调蛋白SISR3的基因组序列，使用网址(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi
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bin/CRISPR)CRISPR
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P进行SISR3基因sgRNA(smallguideRNA)候选靶点的设计，得到的sgRNA1靶位点序列：GTGGATTACCGGGACAAGCA。并将BbsI限制性内切酶粘性末端(序列：AAAATCTCCTACTTCTACGA)添加在靶序列的两端。同时，将载体质粒AtU6
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26SK载体用BbsI限制性内切酶进行单酶切，酶切反应条件为37℃，酶切30分钟。接下来将形成的sgRNA1与通过BbsI限制性内切酶酶切的At本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种负调控因子SlSR3基因在提高植物脐腐病抗性上的应用，其特征在于，所述的SlSR3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.一种由负调控因子SlSR3基因编码的蛋白在提高植物脐腐病抗性上的应用，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的植物为番茄。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的负调控因子SlSR3基因具体表现为SlSR3基因敲除后，降低了番茄幼苗的株高。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的负调控因子SlSR3基因具体表现为SlSR3基因敲除后，加剧了番茄的落花落果。6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的负调控因子SlS...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖伟彪，侯雪梅，齐娜娜，李翊华，王桐，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：