本发明专利技术提供了一种腺苷脱氨酶含量的检测方法及其应用。所述腺苷脱氨酶含量的检测方法包括如下步骤：利用腺苷的本征荧光，采用腺苷脱氨酶水解腺苷，通过荧光分析法检测腺苷脱氨酶的含量。腺苷本身具有较强的荧光，其被腺苷脱氨酶水解后，所得水解产物荧光降低，从而导致检测体系溶液荧光强度降低，通过腺苷水解前后荧光强度变化，对体系中腺苷脱氨酶的含量进行检测。本发明专利技术中所述腺苷脱氨酶含量的检测方法操作简单、不需要大型仪器设备、材料便宜易得，能够准确快速地检测待测样品中腺苷脱氨酶的含量，且展现出良好的灵敏度和特异性，具有较为广阔的应用前景。较为广阔的应用前景。较为广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种腺苷脱氨酶含量的检测方法及其应用
[0001]本专利技术属于生化检测
，具体涉及一种腺苷脱氨酶含量的检测方法及其应用。
技术介绍
[0002]腺苷脱氨酶(adenosine deaminase，ADA)是一种巯基酶，属于细胞免疫功能相关的核酸代谢酶类。ADA缺乏可导致核酸代谢障碍，影响胸腺发育，从而引起免疫功能缺陷。重症联合免疫缺陷病即与ADA缺乏相关。
[0003]人体许多组织中均有ADA分布，其中胸腺、脾和其他淋巴组织中含量最高，肺、肝、肾和骨胳肌等处含量较低。血清中的ADA主要来自肝脏，是反映肝损伤的敏感指标，可作为肝功能常规检查项目之一。测定血清中ADA的活性，可用于诊断急性肝损伤及残留病变、辅助判断慢性肝病、诊断肝纤维、鉴别黄疸和阿米巴肝脓肿等。脑脊液中ADA检测可作为中枢神经系统疾病鉴别和诊断的重要指标。
[0004]此外，ADA在良恶性难辨的渗出液鉴别诊断上也具有重要价值。因此，测定体液和血液中的ADA水平对免疫功能的研究以及相关疾病的鉴别、诊断和治疗具有十分重要的意义。开发简单、快速、灵敏的ADA检测方法也越来越受到广泛的重视。
[0005]随着对ADA的深入研究，其检测方法也不断发展。目前市场上已发展出四代ADA检测方法。
[0006]第一代ADA测试方法由于高底物浓度造成吸光度过高，其仅适合在腺苷浓度低于40μM时使用。如此低的底物浓度达不到底物饱和要求，造成ADA活性检测失真。因此该法不能满足临床应用。
[0007]第二代ADA测试方法所需仪器简单、试剂易配制，但灵敏度低，易受外源性NH3影响，空白过高，不能直接测定红细胞ADA活性。同样原因，对于ADA偶联谷氨酸脱氢酶(Glutamate Dehydrogenase，GLDH)反应方法来说，其是通过测量340nm处NADPH吸光度下降的速度来测算ADA活性。所述方法也因血清含氨，以及测试系统中过高NADPH造成非特异性氧化而易受干扰。
[0008]对于第三代ADA测试方法，在293nm时血清吸光度太高，造成临床应用不便。第四代ADA测试方法虽克服了以往ADA测试的困难，但其所需的试剂成本高，阻碍了实际临床使用。鉴于现有技术的上述不足，亟需一种新型的ADA检测方法。
技术实现思路
[0009]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种腺苷脱氨酶含量的检测方法及其应用。本专利技术中检测腺苷脱氨酶含量的方法操作简单、不需要大型仪器设备、材料便宜易得，能够准确快速地检测待测样品中腺苷脱氨酶的含量，且展现出良好的灵敏度和特异性，具有较大的应用推广价值。
[0010]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0011]第一方面，本专利技术提供一种腺苷脱氨酶含量的检测方法，所述腺苷脱氨酶含量的检测方法包括如下步骤：
[0012]利用腺苷的本征荧光，采用腺苷脱氨酶水解腺苷，通过荧光分析法检测腺苷脱氨酶的含量。
[0013]本专利技术选择合适的腺苷，并同时采用腺苷脱氨酶水解腺苷，通过荧光分析法检测腺苷脱氨酶的含量。所述检测腺苷脱氨酶含量的原理是腺苷具有较强的本征荧光，当腺苷被腺苷脱氨酶水解，生成氨和肌苷后，其水解产物释放较低强度的荧光；在一定浓度范围内，腺苷脱氨酶的浓度越高，腺苷被消耗得越多，检测体系对外释放的荧光就越弱，通过荧光强度变化对体系中的腺苷脱氨酶的含量进行检测。
[0014]优选地，所述腺苷包括一磷酸腺苷、二磷酸腺苷或三磷酸腺苷中任意一种或至少两种的组合，优选为三磷酸腺苷。
[0015]在相同条件下三磷酸腺苷(ATP)比一磷酸腺苷(AMP)和二磷酸腺苷(ADP)的荧光更明显，更适合应用于检测。
[0016]优选地，所述腺苷脱氨酶含量的检测方法包括如下具体步骤：
[0017](1)将腺苷、腺苷脱氨酶标准品和水解反应溶剂配制成水解反应混合液，进行水解反应，检测反应后的荧光强度；同步检测待测样品和空白对照反应后的荧光强度；
[0018](2)根据腺苷脱氨酶标准品与空白对照反应后的荧光强度差值，制作标准曲线，根据标准曲线计算待测样品中腺苷脱氨酶含量。
[0019]优选地，步骤(1)中，所述水解反应溶剂包括HEPES缓冲液或水，优选为HEPES缓冲液。
[0020]优选地，所述HEPES缓冲液的浓度为8
‑
12mM，例如可以是8mM、9mM、10mM、11mM或12mM等，所述HEPES缓冲液的pH值为7.2
‑
7.6，例如可以是7.2、7.4或7.6等。
[0021]优选地，步骤(1)中，所述水解反应混合液中所述腺苷的浓度为45
‑
55mM，例如可以是45mM、48mM、50mM、52mM或55mM等。
[0022]优选地，步骤(1)中，所述水解反应混合液中所述腺苷脱氨酶标准品的浓度为0
‑
25U/mL，例如可以是0U/mL、0.25U/mL、5U/mL、12.5U/mL或25U/mL等。
[0023]优选地，步骤(1)中，所述水解反应的温度为30
‑
37℃，例如可以是30℃、32℃、35℃或37℃等，所述水解反应的时间为0.5
‑
2h，例如可以是0.5h、1h、1.1h、1.2h、1.3h、1.4h、1.5h或2h等。
[0024]优选地，步骤(1)中，所述荧光检测参数为：激发波长为270
‑
280nm，例如可以是270nm、275nm或280nm等，发射波长为360
‑
400nm，例如可以是360nm、380nm、390nm或400nm等。
[0025]优选地，步骤(2)中，所述标准曲线的纵坐标为腺苷脱氨酶标准品与空白对照反应后的荧光强度的差值，所述标准曲线的横坐标为腺苷脱氨酶标准品溶液的浓度。
[0026]作为本专利技术的优选技术方案，所述腺苷脱氨酶含量的检测方法包括如下步骤：
[0027](1)将腺苷、腺苷脱氨酶标准品和水解反应溶剂配制成水解反应混合液，所述水解反应混合液中腺苷的浓度为45
‑
55mM，所述腺苷脱氨酶标准品的浓度为0
‑
25U/mL，在30
‑
37℃下水解反应0.5
‑
2h；检测反应后的荧光强度，所述荧光检测参数为：激发波长为270
‑
280nm，发射波长为360
‑
400nm；同步检测待测样品和空白对照反应后的荧光强度；
[0028](2)根据腺苷脱氨酶标准品与空白对照反应后的荧光强度差值，制作标准曲线，所述标准曲线的纵坐标为腺苷脱氨酶标准品与空白对照反应后的荧光强度的差值，所述标准曲线的横坐标为腺苷脱氨酶标准品溶液的浓度，根据标准曲线计算待测样品中腺苷脱氨酶含量。
[0029]第二方面，本专利技术提供一种检测腺苷脱氨酶含量的试剂盒，所述检测腺苷脱氨酶含量的试剂盒中的试剂包括腺苷和腺苷脱氨酶标准品。<本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种腺苷脱氨酶含量的检测方法，其特征在于，所述腺苷脱氨酶含量的检测方法包括如下步骤：利用腺苷的本征荧光，采用腺苷脱氨酶水解腺苷，通过荧光分析法检测腺苷脱氨酶的含量。2.根据权利要求1所述的腺苷脱氨酶含量的检测方法，其特征在于，所述腺苷包括一磷酸腺苷、二磷酸腺苷或三磷酸腺苷中任意一种或至少两种的组合，优选为三磷酸腺苷。3.根据权利要求1或2所述的腺苷脱氨酶含量的检测方法，其特征在于，所述腺苷脱氨酶含量的检测方法包括如下具体步骤：(1)将腺苷、腺苷脱氨酶标准品和水解反应溶剂配制成水解反应混合液，进行水解反应，检测反应后的荧光强度；同步检测待测样品和空白对照反应后的荧光强度；(2)根据腺苷脱氨酶标准品与空白对照反应后的荧光强度差值，制作标准曲线，根据标准曲线计算待测样品中腺苷脱氨酶含量。4.根据权利要求3所述的腺苷脱氨酶含量的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述水解反应溶剂包括HEPES缓冲液或水，优选为HEPES缓冲液；优选地，所述HEPES缓冲液的浓度为8
‑
12mM，所述HEPES缓冲液的pH值为7.2
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7.6。5.根据权利要求3或4所述的检腺苷脱氨酶含量的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述水解反应混合液中所述腺苷的浓度为45
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55mM；优选地，步骤(1)中，所述水解反应混合液中所述腺苷脱氨酶标准品的浓度为0
‑
25U/mL；优选地，步骤(1)中，所述水解反应的温度为30
‑
37℃，...
【专利技术属性】
技术研发人员：王琰，詹深山，蒋佳俊，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所，
类型：发明
国别省市：
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