用于确定干细胞的分化状态的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于基于细胞信号转导途径的活跃性来确定干细胞的分化状态的方法。所述方法能够用于确定干细胞的多能性、专能性或单能性。本发明专利技术还涉及一种用于生成参考库的方法，所述参考库用在用于确定分化状态的方法中。本发明专利技术还涉及一种用于运行该方法的非瞬态存储介质、一种适合用于执行该方法的成套工具以及所述成套工具在执行本发明专利技术的方法中的用途。途。途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于确定干细胞的分化状态的方法


[0001]本专利技术涉及用于确定干细胞的分化状态的方法。该方法还涉及用于生成参考库的方法，该参考库用在用于表征干细胞的方法中。另外，本专利技术涉及适合用于本文描述的方法的试剂盒。

技术介绍

[0002]相对少量的信号转导途径的协同活动控制胚胎发育并因此控制具有不同分化潜力的干细胞的细胞分裂、迁移和分化。信令途径在进化上非常保守并且控制这些基本的细胞机制。
[0003]信号转导途径能够大致分为激素驱动的核受体途径(例如，雄激素和雌激素受体途径)、发育途径(例如，Wnt、Hedgehog、TGFβ、Notch途径)、炎症NFκB途径以及高度复杂的生长因子调节的信号转导途径网络，其中，PI3K
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AKT
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mTOR途径可能是最重要的一个，紧邻MAPK和JAK
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STAT途径。除了胚胎发育以外，它们还控制重要的生理过程，例如，造血和免疫反应生成、组织再生、毛发生长以及肠粘膜更新。在生理细胞过程和胚胎发育这两者中，它们的活跃性都受到严格控制。
[0004]干细胞技术在过去几十年中已经成熟，主要的突破性发现和随后的发展是可靠的诱导性多能干细胞(iPS)的生成。诱导性多能干细胞(iPS)技术的发展得到了鲁棒的方案来实现从每个健康或患病的个体生成多能干细胞系[Chac
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Mart
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nez等人，Development，第145卷，第15期，第dev165399页，2018年8月]。然而，其他类型的干细胞也是已知的，如人类胚胎干细胞、器官干细胞，例如，造血干细胞或肠隐窝干细胞。虽然iPS细胞和HES细胞是多能的，这意味着它们原则上能够形成人体的所有细胞类型，但是器官干细胞大多是专能的，并且能够形成构成器官组织的多种细胞类型；器官中的祖干细胞通常只能形成一种成熟细胞类型。
[0005]iPS细胞的培养和向特定细胞类型的分化越来越多地用于探索对体外疾病模型的建立，以获得关于疾病病理生理学的知识和用于药物开发目的。基于iPS的疾病模型是独特的，因为疾病是在供体个体的遗传背景下生成的。除了了解疾病病理生理学和药物开发以外，基于iPS的疾病模型的效用还可能在于为患有某些遗传疾病的患者建立个性化的疾病模型。在难以获得病理学材料的情况下(例如对于患有像癫痫和认知障碍这样的脑部病症的儿童)，这可能是特别相关的。在这种情况下，iPS导出的疾病模型通过使得能够识别致病缺陷和对特定患者的药物疗效进行体外研究来达到诊断目的。
[0006]对于简单的遗传疾病，通过CRISP
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CAS技术的发展，能够促进生成一种控制“伴侣”iPS细胞系，其中，突变得到了纠正。对于复杂的遗传疾病，这是不可能的。iPS技术的优点在于有可能收集越来越多的从患有相同疾病的患者导出的iPS细胞系，并且以标准化的方式在培养物中重现疾病。这样的患者导出的疾病模型然后可以用作“培养皿”中的代理患者，以例如用于药物开发目的。因此，需要进行测定以弄清楚各个使用批次的干细胞具有相同的特性，定义朝向模拟疾病所需的细胞类型的分化步骤，以及评估例如向细胞培养疾病模
型中添加药物的效果。
[0007]干细胞使得体外培养的分化细胞或组织能够返回患者体内以进行器官或组织修复。虽然人类胚胎干细胞(HES)用于探索一些再生医学应用，但是iPS细胞系通常在再生医学中具有更大的应用潜力[Chac
ó
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Mart
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nez等人，Development，第145卷，第15期，第dev165399页，2018年8月]。为了获得特定的分化的器官细胞，在将祖细胞递送给患者后，必须完全在体外或者替代地部分在体内地重新捕获在正常胚胎发育中发生的分化步骤。
[0008]通过使用干细胞(特别是iPS细胞)来生成用于组织修复的细胞类型具有处置和潜在治愈多种疾病的巨大临床潜力。然而，要实现基于干细胞治疗的真正再生医学，仍然需要克服许多障碍，部分原因是对如何生成足够纯度的正确细胞的理解仍不完整[Badylak等人，npj Regenerative Medicine，第2卷，第1期，第2页，2017年1月]。因此，需要进行测定以弄清楚各个使用批次的干细胞具有相同的特性，定义朝向模拟疾病所需的细胞类型的分化步骤，以及对在体外培养和操作后返回患者的细胞批次的纯度和分化状态进行量化。
[0009]干细胞系的问题是：包括iPS系，并不总是具有相同的多能特性。这部分取决于它们生成的方式[Strano等人，https://doi.org/10.1016/j.celrep.2020.107732]。在培养物中建立和维持人类干细胞系的多能性状态是一项挑战[International Stem Cell Initiative，Nat Commun，第9卷，第1期，第1925页，15 2018年]。多种信号转导途径(例如，PI3K、Wnt、Hedgehog、TGFβ、STAT3途径)安排干细胞多能性的状态[Ying等人，Stem Cell Reports，第8卷，第6期，第1457
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1464页，2017年6月；Sokol，Development，第138卷，第20期，第4341
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4350页，2011年10月；Huang等人，Cell Res.，第19卷，第10期，第1127
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1138页，2009年10月；Massagu
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，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.，第13卷，第10期，第616
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630页，2012年10月；Yu等人，Development，第143卷，第17期，第3050
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3060页，2016年9月]。因此，非常需要测定来量化多能性的程度和分化成各种分化谱系的分化能力，并且还使得能够定量地比较各个使用批次(例如在冷冻之前和之后，在传代干细胞培养物之后)的干细胞以避免选择具有不同特性的(一个或多个)干细胞克隆。
[0010]iPS导出的疾病模型的开发伴随着挑战，最重要的是疾病模型开发的再现性[van de Stolpe等人，Lab Chip，第13卷，第18期，第3449
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3470页，2013年9月]。这需要标准化的分化步骤来可靠地获得所需的细胞或组织类型。因此，非常需要测定来量化多能性的程度和分化成各种分化谱系的分化能力，并且还使得能够定量地比较各个使用批次的(分化的)干细胞。
[0011]干细胞用于临床再生医学的特殊挑战
[0012]为了获得对临床使用的监管批准，细胞培养和分化应当是非常可控和可重现的，从而需要严格的质量控制协议和标准化。随着用于再生医学目的的干细胞衍生物的临床使用，出现了大量的质量控制要求。我们预计需要文件记录连续的分化步骤(例如经过定形内胚层阶段以获得生成胰岛素的胰腺细胞)以及最终产品的详细表征。信号转导途径的活跃性分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于基于对至少三种细胞信号转导途径的活跃性的确定或确定结果来确定干细胞的分化状态的体外或离体方法，所述至少三种细胞信号转导途径选自包括TGFβ、Notch、JAK
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STAT3、Hedgehog和Wnt的组，所述方法包括：计算针对所述至少三种细胞信号转导途径的活跃性的数值；将所计算的针对所述干细胞中的所述至少三种细胞信号转导途径的活跃性的数值与计算的针对至少三种参考细胞信号转导途径的活跃性的数值进行比较；基于所比较的细胞信号转导途径的活跃性来确定所述干细胞的所述分化状态，其中，所述干细胞的所述分化状态被确定为多能、专能、单能或至少部分分化，其中，所述比较的步骤是通过将所述干细胞中的所述至少三种细胞信号转导途径的活跃性与参考库中的相同的三种途径的活跃性进行比较来执行的，所述参考库包括在至少两个参考样本中确定的所述至少三种细胞信号转导途径的活跃性，其中，针对所述至少三种细胞信号转导途径的活跃性的所述数值是基于在所述干细胞中测量的TGFβ、Notch、JAK
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STAT3、Hedgehog或Wnt细胞信号转导途径的三种或更多种靶基因的表达水平来计算的，其中，所述计算包括：确定所述干细胞中的TGFβ、Notch、JAK
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STAT3、Hedgehog或Wnt转录因子(TF)元件的水平，所述TGFβ、Notch、JAK
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STAT3、Hedgehog或Wnt TF元件控制所述TGFβ、Notch、JAK
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STAT3、Hedgehog或Wnt细胞信号转导途径的所述三种或更多种靶基因的转录，所述确定至少部分基于评价将所述TGFβ、Notch、JAK
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STAT3、Hedgehog或Wnt细胞信号转导途径的所述三种或更多种靶基因的表达水平与所述TGFβ、Notch、JAK
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STAT3、Hedgehog或Wnt TF元件相关的数学模型；基于所确定的所述干细胞中的所述TGFβ、Notch、JAK
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STAT3、Hedgehog或Wnt TF元件的水平来推断所述干细胞中的所述TGFβ、Notch、JAK
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STAT3、Hedgehog或Wnt细胞信号转导途径的所述活跃性，并且其中：所述三种或更多种TGFβ靶基因选自包括以下各项的组：ANGPTL4、CDC42EP3、CDKNIA、CDKN2B、CTGF、GADD45A、GADD45B、HMGA2、ID1、IL11、SERPINE1、INPP5D、JUNB、MMP2、MMP9、NKX2
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5、OVOL1、PDGFB、PTHLH、SGK1、SKIL、SMAD4、SMAD5、SMAD6、SMAD7、SNAI1、SNAI2、TIMP1，以及VEGFA；所述三种或更多种Notch靶基因选自包括以下各项的组：CD28、CD44、DLGAP5、DTX1、EPHB3、FABP7、GFAP、GIMAP5、HES1、HES4、HES5、HES7、HEY1、HEY2、HEYL、KLF5、MYC、NFKB2、NOX1、NRARP、PBX1、PIN1、PLXND1、PTCRA、SOX9，以及TNC；所述三种或更多种JAK
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STAT3靶基因选自包括以下各项的组：AKT1、BCL2、BCL2L1、BIRC5、CCND1、CD274、CDKN1A、CRP、FGF2、FOS、FSCN1、FSCN2、FSCN3、HIF1A、HSP90AA1、HSP90AB1、HSP90B1、HSPA1A、HSPA1B、ICAM1、IFNG、IL10、JunB、MCL1、MMP1、MMP3、MMP9、MUC1、MYC、NOS2、POU2F1、PTGS2、SAA1、STAT1、TIMP1、TNFRSF1B、TWIST1、VIM，以及ZEB1；所述三种或更多种Hedgehog靶基因选自包括以下各项的组：GLI1、PTCH1、PTCH2、IGFBP6、SPP1、CCND2、FST、FOXL1、CFLAR、TSC22D1、RAB34、S100A9、S100A7、MYCN、FOXM1、GLI3、TCEA2、FYN，以及CTSL1；所述三种或更多种Wnt靶基因选自包括以下各项的组：KIAA1199、AXIN2、RNF43、TBX3、TDGF1、SOX9、ASCL2、IL8、SP5、ZNRF3、KLF6、CCND1、DEFA6，以及FZD7。
2.根据权利要求1所述的体外或离体方法，其中，所述三种或更多种细胞信号转导途径的活跃性还包括选自包括以下各项的组的一种或多种细胞信号转导途径的活跃性：PI3K
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FOXO、AR、ER、PR、NFkB、AP1
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MAPK、JAK
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STAT1/2和PR途径。3.根据前述权利要求中的任一项所述的体外或离体方法，其中，所述干细胞为iPS细胞、胚胎干细胞、器官样细胞、器官或组织来源的干细胞或癌症干细胞。4.根据前述权利要求中的任一项所述的体外或离体方法，其中，所述方法还包括确定所述三种或更多种细胞信号转导途径的所述细胞信号转导途径的活跃性的步骤。5.根据权利要求4所述的体外或离体方法，其中，所述方法还包括确定针对每种细胞信号转导途径的三种或更多种靶基因的所述表达水平的步骤，并且其中，所述三种或更多种细胞信号转导途径的活跃性是基于针对每种细胞信号转导途径的所述三种或更多种靶基因的所述表达水平来确定的。6.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述干细胞是胚胎干细胞，并且其中，当满足以下准则中的三个或更多个，优选四个，更优选五个时，确定所述胚胎干细胞的所述分化状态为多能：TGFβ信号转导高；Notch信号转导高；STAT3信号转导高；Hedgehog信号转导高；Wnt信号转导低，或者其中，当满足少于三个上述准则时，确定所述胚胎干细胞的所述分化状态为至少部分分化。7.根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其中，所述干细胞是诱导性多能干细胞，并且其中，当满足以下准则中的三个或更多个，优选四个，更优选五个时，确定所述诱导性多能干细胞的所述分化状态为多能：TGFβ信号转导高；Notch信号转导高；STAT3信号转导高；Hedgehog信号转导高；Wnt信号转导低，或者其中，当满足少于三个上述准则时，确定所述诱导性多能干细胞的所述分化状态为至少部分分化。8.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述干细胞是器官干细胞，并且其中，当满足以下准则中的三个或更多个时，确定所述器官干细胞的所述分化状态为多能：Notch信号转导高；Wnt信号转导高；Hedgehog信号转导低；MAPK信号转导低；
ER信号转导低，或者其中，当满足少于三个上述准则时，确定所述器官干细胞的所述分化状态为部分分化，优选地，其中，所述器官干细胞是肠干细胞。9.根据前述权利要求中的任一项所述的体外或离体方法，其中，用于确定所述干细胞的分化状态的所述细胞信号转导途径的活跃性用于确定所述干细胞的多能性或专能性，其中，所述干细胞的所述多能性或专能性还用于以下各项中的一项或多项：预测所述干细胞维持干性和/或维持干细胞表型的能力；和/或预测所述干细胞引起分化为外胚层、内胚层和中胚层谱系或其细胞或组织类型中的任一项的能力，和/或预测所述干细胞维持静止、增殖和再生之间的平衡的能力，并且/或者其中，确定所述干细胞的所述分化状态还包括确定所述干细胞的谱系，优选地，其中，所述谱系选自包括以下各项的组：胚胎干细胞(未分化的)、前部原条纹、中胚层、定形内胚层、前部前肠、后部前肠、中肠/后肠、多能干细胞、专能干细胞、器官干细胞、肠干细胞、神经祖细胞、终末分化细胞，并且/或者其中，所述方法用于通过将针对所述干细胞的所述三种或更多种细胞信号转导途径的活跃性和所述三种或更多种期望的参考信...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：皇家飞利浦有限公司，
类型：发明
国别省市：