本发明专利技术公开了一种血浆中斑蝥素测定方法，该方法为气相色谱－质谱联用，其中气相条件为：色谱条件：载气：惰性气体；进样口温度：２３０－２８０℃；进样方式：不分流进样；进样量：０．５－２μｌ，柱流量０．５－２ｍｌ／ｍｉｎ；升温程序：５０－７０℃保持１ｍｉｎ，以４－８℃／ｍｉｎ升温至２００－２４０℃，保持１ｍｉｎ，以１５－２５℃／ｍｉｎ升温至２６０－３００℃，保持２－４ｍｉｎ；其中质谱条件为：离子源温度：２３０－２８０℃；接口温度：２３０－２８０℃；电子轰击能：６０－９０ｅｖ；溶剂切除时间：３－５ｍｉｎ；ＳＩＭ检测，ｍ／ｚ＝１２８。本发明专利技术能够检测血浆中低剂量的斑蝥素，具有良好的精密度和准确度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供一种针对来源于中药的单体化合物在血浆中含量的测定方 法，特别涉及血浆中。
技术介绍
斑蝥为芫菁科昆虫南方大斑蝥Mylabris phalerata Pallas或黄黑小斑 蝥Mylabris cichorii Linnaeus的干燥全虫，是我国最早被发现的具有抗 癌作用的中药，其性寒味辛，有大毒。据《神农本草经》记载，斑蝥可以治 疗痈疽、溃疡、癣疮等病症，具有攻毒蚀疽、破血散结的作用。现代药学研 究表明其主要活性成分是斑蝥素(cantharidin)，1， 2顺式一二 甲基，3， 6—氧桥六氢化邻苯二甲酸酐。1810年法国药学家Robiquet从绿 芫菁Lytta vesicatoria中首次得到斑蝥素晶体现代药理学证明斑蝥素可干 扰癌细胞核酸及蛋白质代谢，能明显抑制多种动物移植性肿瘤，具有抗癌作 用。在临床上，斑蝥素在治疗癌症和一些疑难杂症方面显示出其独特的疗效。 目前国内市场上有复方斑蝥注射液(商品名为艾迪注射液，国药准字 Z52020236，贵州益佰制药股份有限公司)、复方斑蝥胶囊(国药准字 Z19993294;国药准字Z20003270，宝鸡华西制药股份有限公司；国药准字 ZF20000427)，均证实有较好的抗癌作用。斑蝥素是白色片状晶体，12(TC升华，熔点215 216。C，极微溶于冷水， 微溶于热水，易溶于丙酮(l g: 40 mL)、氯仿(l g: 65mL)、 二氯甲垸、乙 醚(l g: 560 mL)、乙酸乙酯等油脂(l g: 150ml)为邻苯二甲酸酐结构，在酸性条件下稳定，无共轭吸收基团，紫外吸收弱，多采用气相色谱法测定斑蝥素的体外含量，2005年中国药典规定用气相色谱法测定芫菁虫内斑蝥素含斑蝥素为毒性抗癌药，临床用量很小，血药浓度很低，目前没有针对临 床使用剂量下的血浆中低浓度斑蝥素的测定方法，建立对低浓度斑蝥素的测 定方法会对斑蝥素各类制剂的质量控制及用药安全具有重大意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种血浆中，该方法能够高灵敏 度地测定血浆中低浓度斑蝥素的含量。本专利技术目的是通过如下技术方案实现本专利技术所述的血浆中，其特征在于为气相色谱-质谱联 用方法(GC-MS);其中气相色谱条件为采用(20-40) mX (0.20-0. 35)mmX (0. 20-0. 35) Pm的色谱柱；载气惰性气体；进样口温度230-280°C;进样量:0.5-2W， 柱流量0. 5-2ml/min;升温程序50-7(TC保持lmin，以4-8°C/min升温至 200-240°C，保持lmin，以15-25。C/min升温至260-300。C，保持2-4min;其中质谱条件为离子源温度230-280°C;接口温度230_280°C;电 子轰击能60-90ev;溶剂切除时间3-5min;单离子检测，m/z=70-135。本专利技术所述的一种血浆中，其优选的气相色谱-质谱联用方法为其中气相色谱条件:采用30mX0.25mmX0.25nm色谱柱；载气氦气， 纯度:99.999%;进样口温度250°C;进样方式不分流进样；进样量1W， 柱流量lml/min;升温程序6(TC保持lmin，以6tVmin升温至220°C ，保持 lmin,以20。C/min升温至280。C，保持3min;其中质谱条件为离子源温度25CTC;接口温度250°C;电子轰击能70ev;溶剂切除时间4min;单离子检测，m/z=90-130，其中m/z值优选128 或96.01。本专利技术所述的血浆中，其中血浆处理方法为血浆加入3-7M的酸；萃取剂选自氯仿，乙酸乙酯，乙醚，二氯甲烷等油脂 或甲苯，甲醇，乙腈中的任意一种；涡旋震荡80-100秒，14000-16000r/min 高速离心10-25min，吸取上清液，微孔滤膜过滤，氮气常温下吹干，用乙酸 乙酯、甲醇、乙腈、氯仿、甲苯、乙醚，二氯甲垸中的任意一种复溶；优选 乙酸乙酯复溶；所述的酸可以为盐酸、磷酸、硫酸中的任意一种。 本专利技术所述的血浆中，其中血浆处理方法优选为犬血浆500W，加入6M的盐酸200W，涡旋30s;萃取剂为2ml，选自氯 仿，乙酸乙酯，乙醚，二氯甲垸等油脂或甲苯，甲醇，乙腈中的任意一种；涡 旋震荡90s， 15000r/min高速离心15min，吸取上清液1600W， 0.25陶微孔 滤膜过滤，吸取过滤液1400W，氮气常温下吹干，用的乙酸乙酯复溶， 进样1W。所述萃取剂优选乙酸乙酯。本专利技术所述的血浆中，其特征在于在血浆中加入内标物 氯贝丁酯。具体方法为取500ul的含药血浆，加入200ul的6mol/L的 盐酸，涡旋30s，加入10ul的内标液(28ng/ml)加入2ml的乙酸乙酯，涡 旋90s, 15000r/min高速离心15min，吸取上清液1. 6ml， 0. 25u m微孔滤膜 过滤,氮气常温下吹干，100 u 1乙酸乙酯复溶。本专利技术提供了对低浓度斑蝥素的测定，对斑蝥素各类制剂的质量控制及 用药安全具有重大意义。在方法中通过对气相条件中程序升温条件的优化， 使斑蝥素和内标完全分开，却不被血样中的杂质干扰，提高了方法的专属性， 从而使用低分辨率的质谱即可完成定量要求。本专利技术通过对方法中各参数的 筛选，实现了检测低剂量斑蝥素技术目的，具有良好的精密度和准确度。下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本专利技术。 实验例1萃取环境选择取4份500W空白血浆，分别配置成含斑蝥素浓度为11. 5Pg/ml的含 药血浆，加入200WHCL (2.0， 3.0， 6.0, 12M)，加入lml乙酸乙酯，60s 涡旋震荡，吸取上清液，氮气吹干，复溶，进样。表l斑蝥素萃取酸性环境筛选盐酸(mol/L) 峰面积4.0 124549175.0 135181886.0 202134558.0 16207734以斑蝥素的峰面积值比较，峰面积越大说明斑蝥素的量越大，由表1可 见，500 u 1的含药血浆中加入200 u 1不同浓度的盐酸提取斑蝥素，加入200 u 1的6mol/L的盐酸对斑蝥素的提取率最高。实验例2精密度和准确度试验取空白血浆500W，配制成斑蝥素浓度分别为2. 14， 85.6， 256. 8ng/ml的对照品血浆数份，按本专利技术实施1的"血浆样品处理方法5. 1"项下处理 每个浓度进行5个样本分析，计算回收率，同一样本， 一日内测定5次，计 算日内变异，每日测定1次，计算日间变异，进行气相色谱-质谱分析。表2斑蝥素日内精密度和日间精密度(n=5)斑蝥素浓曰内曰间度XSDRSDXSDRSD(ng/ml)2. 142. 560. 3915. 222.371.0819.885.682. 822. 002.4186. 666.036. 96256.8241. 7911.404. 72245. 0921.78.86由表可知，(内标法计算)日内精密度在2.4-15.2%之间，日间精密度在 6.9-19.8%之间，精密度均小于20%，符合药典中的精密度(RSD〈20%)和准 确度(RSD<20%)的规定，表明此方法准确、可靠。实验例3回收率试验按照本专利技术技术方案所述的方法，配制高(256.8 ng/ml)、中(85.6ng/ml)、低(2. 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种血浆中斑蝥素的检测方法，其特征在于为气相色谱－质谱联用方法； 其中气相色谱条件为：采用（２０－４０）ｍ×（０．２０－０．３５）ｍｍ×（０．２０－０．３５）μｍ的色谱柱；载气：惰性气体；进样口温度：２３０－２８０℃；进样量：０．５－ ２μｌ，柱流量０．５－２ｍｌ／ｍｉｎ；升温程序：５０－７０℃保持１ｍｉｎ，以４－８℃／ｍｉｎ升温至２００－２４０℃，保持１ｍｉｎ，以１５－２５℃／ｍｉｎ升温至２６０－３００℃，保持２－４ｍｉｎ； 其中质谱条件为：离子源温度：２３０－２ ８０℃；接口温度：２３０－２８０℃；电子轰击能：６０－９０ｅｖ；溶剂切除时间：３－５ｍｉｎ；单离子检测，ｍ／ｚ＝７０－１３５。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱春燕，党云洁，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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