用于转运和培养漂浮组织的方法和系统技术方案

提供了用于使用夹心构建体培养漂浮目标组织的装置、系统和方法。实施方案包括制备在用于运输的夹心构建体中的漂浮目标组织，以及制备包含活体肿瘤组织的夹心构建体，用于评估治疗肿瘤的候选疗法。漂浮目标组织可包括各种细胞类型，包括癌细胞和肿瘤。包括癌细胞和肿瘤。包括癌细胞和肿瘤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于转运和培养漂浮组织的方法和系统
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求获得2020年3月12日提交的美国临时申请第62/988,472号的优先权的权益，该申请的公开内容通过引用以其整体纳入。


[0003]本公开一般性地涉及培养漂浮组织的方法和应用。

技术介绍

[0004]白色脂肪组织
[0005]白色脂肪组织(WAT)是健康状态和疾病状态中的一个关键器官。作为能量蓄积库和内分泌器官，WAT调节能量稳态、免疫力、血管紧张度和凝血功能。作为肥胖症的疾病器官，WAT的过度增长是每个主要死亡原因的强效风险因素，包括心脏病、糖尿病、卒中和癌症。适当地，WAT是密集研究的对象。
[0006]然而，原发性WAT很难在体外维持，因为脂肪细胞是漂浮的、终末分化的、和易于破裂的。自20世纪70年代以来，已经报道了克服这些障碍的方法。虽然这些技术在啮齿动物的WAT中是部分成功的，但它们罕有扩展到人类WAT。啮齿类动物和人类的WAT之间存在着深刻的差异，这一持久的障碍拖慢了治疗人类疾病的进展。
[0007]大多数WAT研究通过依靠体外分化的前体脂肪细胞(diffAds)完全避免了培养原始WAT的挑战。DiffAds的好处是由非漂浮的基质细胞(stromal cell)产生，使用标准组织培养方法很容易传代。虽然diffAds有时在科学文献中可能被称为"脂肪细胞"，但它们并不等同于本文所描述的脂肪细胞。相反，diffAds模仿脂肪形成的机制。例如，白色脂肪细胞是非粘附性的，代谢活性低，而且是单室的，而diffAds很容易粘附在典型的细胞培养塑料上，代谢活跃，而且是多室的。
[0008]如果没有经过充分验证的成熟人类WAT的体外模型，我们研究生理学和疾病的能力将受到阻碍。这一挑战并不是WAT独有的，对所有人类器官系统的生理忠实模型的需求导致了美国国立卫生院(NIH)微生理系统计划(Microphysiological Systems Program)的建立。微生理系统被定义为使用人类细胞制造的组织工程的、多细胞3D器官构建体，预计将加速从实验室到病床边的转化。作为一项广泛的、多机构的努力，美国国立卫生研究院微生理系统计划还确定了一套严格的基准，可以根据这些基准来评估微生理系统。
[0009]肿瘤微环境
[0010]虽然在乳腺癌研究领域已经取得了很大的进展，但仍然需要适当的模型来准确评估肿瘤微环境在乳腺癌进展中的作用。已知的导致癌症进展和耐药性的因素被归于肿瘤微环境的重塑。其中一些因素包括细胞的串扰(crosstalk)、肿瘤微环境的细胞外基质(ECM)重塑、以及缺氧。
[0011]乳腺肿瘤微环境是一个异质性细胞群的所在地，可能包括脂肪源性基质细胞(ASCs)、脂肪细胞、基质细胞、免疫细胞和癌细胞。这些细胞以复杂的关系共存；这些细胞类
型之间的串扰是相互的，并推动疾病的发展。ASCs被招募到肿瘤微环境中，它们通过多种方式促进肿瘤的发生。ASCs具有免疫调节能力，已被证明能抑制自然杀伤细胞和细胞毒性T淋巴细胞。此外，当ASCs暴露于三阴性乳腺癌细胞(MDA
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MB
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231细胞系)和雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌细胞(MCF
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7细胞系)的分泌组中时，ASCs可以通过经由SMAD3的TGFβ1成为癌症相关的成纤维细胞。癌细胞还可以积极引导基质细胞的代谢活动：成纤维细胞和脂肪细胞可以被引导使用分解代谢途径，通过将乳酸、酮体、谷氨酰胺和脂肪酸转移到癌细胞而给合成代谢的肿瘤生长火上浇油。肿瘤
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基质界面上的癌症相关脂肪细胞可以经历去脂化，并获得成纤维细胞样表型，因为它们经历了癌症介导的脂肪分解，向癌细胞释放游离脂肪酸。此外，脂肪细胞已被证明可以封存和代谢化疗药物，减少肿瘤微环境中的活性药物浓度。
[0012]生长中的肿瘤也会经历免疫细胞的浸润和炎症。巨噬细胞被分泌单核细胞趋化蛋白1和肿瘤坏死因子α(TNFα)的脂肪细胞所招募。激活的巨噬细胞促进了促肿瘤发生性重塑，如血管生成。随着组织的扩张，稳态被破坏，导致常驻的巨噬细胞和肥大细胞释放信号分子，从循环中招募白细胞到生长的组织。在脂肪组织中，巨噬细胞是最常见的白细胞类型。被激活的巨噬细胞会促进促肿瘤发生性重塑，如血管生成。
[0013]随着乳腺癌进展，肿瘤的微环境发生了巨大的变化。发生了ECM的纤维化重塑，称为结缔组织生成。肌成纤维细胞在乳腺脂肪组织重塑中起着主要作用，它通过降解现有的ECM和产生更密集的、纤维状的胶原蛋白I和富含纤连蛋白的基质。基质金属蛋白酶被基质细胞用来降解ECM，从而释放出结合的生长因子，激活细胞生长信号通路，促进肿瘤的发生。基质金属蛋白酶也被用来降解肿瘤
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间质界面的基底膜，基底膜被垂直于肿瘤排列的纤维胶原所取代，以促进肿瘤的入侵。
[0014]肿瘤的生长也创造了缺氧的区域，导致血管生成，这是癌症的一个标志。肿瘤扩大所引起的代谢负担耗尽了微环境的营养和氧气，同时用必须清除的代谢废物污染了它。为了应对这些低氧条件，转录因子缺氧诱导因子1被表达，引发血管生成诱导剂血管内皮生长因子A、胎盘生长因子和血管生成素1的释放。缺氧诱导因子1也可以通过将ATP的生成从氧化磷酸化转移到糖酵解而导致扩张的肿瘤中代谢失调。在肿瘤细胞中，这种转变被称为Warburg效应，甚至可以在正常氧浓度下发生。有趣的是，发现与癌症相关的成纤维细胞在与肿瘤细胞相互的旁分泌中分泌乳酸和丙酮酸，从而使肿瘤细胞通过线粒体氧化代谢产生能量，即观察到了反向Warburg效应。
[0015]迄今为止讨论的所有因素都表明，肿瘤微环境是复杂和动态的。为了试图开发更复杂的乳腺肿瘤模型，重演肿瘤微环境，研究人员正在转向工程化的肿瘤微环境和3D生物打印技术。三维水凝胶是创建更准确的肿瘤模型的一个有趣的选择。它们提供了一个可调谐的平台，允许研究人员选择ECM成分，改变硬度，并控制缺氧水平。虽然三维水凝胶乳腺肿瘤模型允许整合成分有助于建立更加模拟人体生理环境的肿瘤模型，但它们往往仅由一种或两种ECM基质组成，未能考虑到肿瘤微环境的细胞之间复杂的相互作用。一种水凝胶模型通过将HepG2人类肝细胞肝癌细胞系与生长停滞的成纤维细胞在3D胶原蛋白I水凝胶中形成异质球体(heterospheroid)来解决单一细胞类型问题。事实证明，异质球体比二维单层和同质球体细胞培养物更加耐药。虽然这种异质球体模型是水凝胶的改进，但它仍然只包含胶原蛋白I和两种细胞类型。微流控设备是更复杂的模型，可用于将生理现象如液体流动、空间受控的共培养物和信号梯度整合到癌症模型中。在癌症模型中，微流控设备已被用
于研究血管生成、迁移和转移。尽管这些工程化的微系统尽可能地强大和复杂，但它们仍然缺乏准确再现肿瘤微环境的能力，因为它们缺乏肿瘤来源的基质和癌症相关的基质细胞群。患者来源的异种移植(PDX)模型通过使用体内培养的实际乳腺肿瘤，使我们更接近于一个完整的模型，但PDX模型存在一些固有的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于制备用于转运的漂浮组织培养物的方法，其包括：在一个容器中形成第一层支持细胞，所述支持细胞粘附到浸没在水性培养基中的容器的表面；将漂浮组织样品放置到毗连形成的第一层支持细胞的上表面；在第一层支持细胞和组织样品上方放置第二层支持细胞，以形成浸没在水性培养基中的夹心构建体；培养漂浮组织样品，其中组织样品包括来自个体的组织外植体；在夹心构建体上方放置一层保护材料。2.根据权利要求1的方法，其中的保护材料是明胶。3.根据权利要求1的方法，其中在将保护材料层放置在夹心构建体上方之前，夹心构建体被冷冻。4.根据权利要求3的方法，其中通过将所述夹心构建体浸没在生物防冻剂中，并将夹心构建体的温度降低到冰点温度或接近冰点温度来冷冻所述夹心构建体。5.根据权利要求1的方法，其中所述容器是培养皿或多孔板的孔。6.根据权利要求1的方法，进一步包括使得所述保护材料层在一段时间内硬化，其中所述保护材料层以液体形式放置。7.根据权利要求1的方法，其中所述夹心构建体包含组织样品和第一和第二层细胞之间的粘附。8.根据权利要求1的方法，其中漂浮组织样品包含乳腺肿瘤碎片。9.根据权利要求1的方法，其中第一层支持细胞源自来自所述个体的第二漂浮组织样品。10.一种评估个体中肿瘤的候选治疗方法的方法，包...

【专利技术属性】
技术研发人员：F，
申请(专利权)人：凯利奥米克斯公司，
类型：发明
国别省市：