一种检测2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量的方法技术

本发明专利技术涉及一种２－酮基－Ｌ－古龙酸中蛋白质含量的分析方法，采用优化的考马斯亮蓝定量蛋白法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法），通过配制磷酸盐缓冲液、牛血清蛋白质标准溶液、考马斯亮蓝Ｇ－２５０染色剂，在牛血清蛋白质标准溶液中加入考马斯亮蓝Ｇ－２５０染色剂，根据考马斯亮蓝与蛋白质结合后的吸光度增加值绘制标准曲线，然后取２－酮基－Ｌ－古龙酸加入考马斯亮蓝试剂，根据吸光度增加值与蛋白质浓度标准曲线斜率计算出２－酮基－Ｌ－古龙酸中蛋白质含量。该分析方法简便、灵敏，稳定性好，准确率高，重现性好，对检测设备要求低，非常适宜于工业生产中２－酮基－Ｌ－古龙酸中蛋白质含量的分析检测。对保证和指导正常生产具有重大的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种检测2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量的方法一、
；本专利技术涉及一种化学分析方法，特别是一种运用考马斯亮蓝比色法测定2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量的分析方法。二、
技术介绍
s维生素C又名L-抗坏血酸，是人体营养必需的维生素，用途非常广泛，常 被用于食品、饲料及化妆品中，在医药和临床上亦有广泛应用，在国际医药贸易 中^:期占十分重要的地位。其主要的生产方法是莱氏法和两步发酵法。两步发酵 法是我国首创，它是以生物氧化过程代替莱氏路线的部分化学合成过程，进而合 成维生素C。两步发酵法是以D-山梨醇为原料，经黑醋菌和假单孢菌两步发酵得到维生 素C的重要中间体2-酮基-L-古龙酸钠发酵液。发酵液的提取工艺是维生素C生 产行业中较为重视的问题，两步发酵后，发酵液的含量低，且残留有菌丝体、蛋 白质和悬浮微粒等，其中蛋白质的存在对分离提纯带来了困难，并严重影响到 2-酮基-L-古龙酸干品质量，对后续维生素C转化工艺也带来了严重影响。过去 从来没有2-酮基-L-古龙酸蛋白质含量的测定方法。生产中除蛋白质的方法有絮凝法、超滤膜、陶瓷膜，但是这些方法截流蛋白 如何，由于没有合适检测蛋白的方法， 一时无法客观评价，因为没有2-酮基-L-古龙酸蛋白质含量的测定方法，所以在生产实践中几乎只能完全凭借经验处理。5因此，建立科学、准确、方便、快速的一种检测2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量 的方法，对保证和指导正常生产具有重大的意义。目前常用的几种经典的蛋白质的定量检测方法有凯氏定氮法、双縮脲法和紫 外吸收法。凯氏定氮法是目前有机化合物含氮量常用的方法，但此法要求特制玻 璃仪器，操作时间长、复杂，产生毒气；双缩脲法蛋白检测迅速，主要缺点灵敏 度差；紫外吸收法不适于有色物质的检测。近年出现了BCA法和考马斯亮蓝比色法，BCA法检测灵敏度很高，但是受 杂质影响大，主要影响杂质包括具有还原性的醇和糖。考马斯亮蓝比色法检测过 程简单、迅速，适于检测微量蛋白含量。生产中的2-酮基-L-古龙酸发黄，溶液颜色很难处理掉，蛋白含量微量，干 扰物质多，包括含氮物质尿素、还原性的山梨醇、山梨糖，并且2-酮基-L-古龙 酸本身也具有还原性。针对2-酮基-L-古龙酸上述特征，选用考马斯亮蓝法检测 2-酮基-L-古龙酸中的蛋白含量，并对检测条件进行优化。 三、
技术实现思路
；本专利技术提供一种检测方法，其目的在于解决目前无法对2-酮基-L-古龙酸中 蛋白质含量进行检测方面所存在的问题。一种检测2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量的方法，其特征在于具体步骤如下(1) 配制磷酸盐缓冲液(pH7.0):取磷酸二氢钾加氢氧化钠溶液配置pH为 7.0的磷酸盐缓冲液，用水稀释至100m;(2) 配制0.1mg/mL牛血清蛋白质标准溶液称取牛血清蛋白，用少量蒸馏水 溶解定容至100mL，得到lmg/mL蛋白质溶液，移取10mL此蛋白溶液定容至 100mL容量瓶，加入10ml步骤(1 )的磷酸盐缓冲液，去离子水定容，即得0.1mg/mL蛋白质标准液，冰箱中保存，待用；(3) 配制考马斯亮蓝G-250染色剂，O.lg考马斯亮蓝G-250 ,50ml 95%乙醇， 100ml85。/。磷酸，用水定容至1L;冰箱中保存，待用；(4) 配制0.02、 0.04、 0.06、 0.08.、 0.1mg/ml的牛血清蛋白质标准溶液，分别 移取lml的牛血清蛋白质标准溶液至5支试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250 染色剂，制作595nm处考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后吸光度增加值(^^(595)) 与蛋白质浓度(c， mg/mL)关系标准曲线；(5) 供试品溶液的配制① 2-酮基-L-古龙酸干品称取5g2-酮基-L-古龙酸干品，用去离子水将其溶 解至100ml容量瓶，再加入6.5ml 20%KOH稀碱溶液和10mlpH为7的缓冲溶液， 调节供试品pH,去离子水定容；② 2-酮基-L-古龙酸钠醪液2000r/min离心20min，移取上清液2ml至试管 中，然后加入2ml40%KOH稀碱溶液，沸水中煮30min，去离子水将其洗入100ml 容量瓶，再加入4.5ml20X硝酸溶液和10ml pH为7的缓冲溶液，调节供试品pH， 去离子水定容；(6) 测定2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量分别移取lml去离子水一份和供试品溶液两份于三支试管中，前两支试管加 入5ml考马斯亮蓝试剂，第三支试管加入5ml去离子水，120min内分别测定三 支试管中的溶液和去离子水在595nm处吸光度；吸光度的增加量AJ(，广 J2-^^3+為，其中A)为去离子水的吸光度，A为lml去离子水和5ml考马斯亮 蓝G-250溶液的吸光度，^为lml供试品和5ml考马斯亮蓝G-250溶液的吸光 度，為为1ml供试品和5ml去离子水的吸光度；根据吸光度增加值(A^，))与蛋白质浓度(c， mg/mL)标准曲线斜率得出2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量。该检测2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量的方法，适用于2-酮基-L-古龙酸醪液 到2-酮基-L-古龙酸干品的整个过程中的产品。在上述步骤(3)所说的考马斯亮蓝G-250染色剂含有乙醇体积百分浓度为 4.75%，磷酸体积百分浓度为8.5。/。，考马斯亮蓝G-250质量百分浓度为0.1mg/mL。在上述步骤(4)所说的595nm处吸光度增加值与蛋白质浓度关系标准曲线的 绘制，每配制一次考马斯亮蓝G-250染色剂，就需要重新绘制595nm处吸光度 增加值与蛋白质浓度关系标准曲线。在上述歩骤(5)稀碱溶液指可溶的氢氧化物类物质；稀碱的配制原则在于配制 后的溶液应该是均匀混合物，常温下长时间存放无溶质析出。在上述步骤(5)供试品溶液配置中，pH调节范围优化为3.5~7， 0<RSD<3%。 在上述步骤(6)中所说的595nm处吸光度的测量时间优化为加入考马斯亮蓝 染色剂后30 60min内完成，0 <RSD<3% 。RSD为分析过程中的相对标准偏差。本专利技术的优越性在于1、 该专利技术可应用于检测2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量；2、 本专利技术包括595nm处吸收度增加值与蛋白量关系标准曲线的绘制和待测 样品检测两部分，该过程中所配制的考马斯亮蓝溶液可一次大量配制多次使用， 同一批次的考马斯亮蓝溶液可以只做一次595nm处吸光度增加值与蛋白质浓度 关系标准曲线，这样就降低了劳动强度，简化了工作步骤；3、 该专利技术对计算公式进行了完善，对供试品溶液pH范围和检测时间进行 了优化；4、 克服了其他蛋白质含量检测方法的缺点，例如数据重现性差，结果误差 大，操作繁琐，受其他组分影响大等；5、 本专利技术方法简便、灵敏，酸性范围广，时间稳定性好，准确率高，重现 性好，对检测设备要求低，适宜于工业生产上2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量的 分析检测。四附图说明；图1、为标准蛋白质含量与吸光度增值关系标准曲线； 五具体实施方式； 本专利技术采用优化的考马斯亮蓝法检测2-酮基-L-古龙酸中蛋白质含量，本发 明具体包括以下步骤1、 磷酸盐缓冲液(pH7.0):取磷酸二氢钾0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液29.1ml，用水稀释至lOOml， 即得。2、 配制牛血清蛋白标准溶液精确称本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测２－酮基－Ｌ－古龙酸中蛋白质含量的方法，其特征在于具体步骤如下：　（１）配制磷酸盐缓冲液（ｐＨ７．０）：取磷酸二氢钾加氢氧化钠溶液配置ｐＨ为７．０的磷酸盐缓冲液，用水稀释至１００ｍｌ；　（２）配制０．１ｍｇ／ｍｌ牛血清蛋 白质标准溶液：称取牛血清蛋白，用少量蒸馏水溶解定容至１００ｍｌ，得到１ｍｇ／ｍｌ蛋白质溶液，移取１０ｍＬ此蛋白溶液定容至１００ｍＬ容量瓶，加入１０ｍｌ步骤（１）的磷酸盐缓冲液，去离子水定容，即得０．１ｍｇ／ｍＬ蛋白质标准液，冰箱中保存，待用；　（３）配制考马斯亮蓝Ｇ－２５０染色剂，０．１ｇ考马斯亮蓝Ｇ－２５０，５０ｍｌ　９５％乙醇，１００ｍｌ　８５％磷酸，用水定容至１Ｌ；冰箱中保存，待用；　（４）配制０．０２、０．０４、０．０６、０．０８．、０．１ｍｇ／ｍｌ的牛血 清蛋白质标准溶液，分别移取１ｍｌ的牛血清蛋白质标准溶液至５支试管中，加入５ｍｌ考马斯亮蓝Ｇ－２５０染色剂，制作５９５ｎｍ处考马斯亮蓝Ｇ－２５０与蛋白质结合后吸光度增加值（ΔＡ↓［（５９５）］）与蛋白质浓度（ｃ，ｍｇ／ｍＬ）关系标准曲线；　 　（５）供试品溶液的配制：　①２－酮基－Ｌ－古龙酸干品：称取５ｇ　２－酮基－Ｌ－古龙酸干品，用去离子水将其溶解至１００ｍｌ容量瓶，再加入６．５ｍｌ　２０％ＫＯＨ稀碱溶液和１０ｍｌｐＨ为７的缓冲溶液，调节供试品ｐＨ，去离子水定容；　 　②２－酮基－Ｌ－古龙酸钠醪液：２０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，移取上清液２ｍｌ至试管中，然后加入２ｍｌ４０％ＫＯＨ稀碱溶液，沸水中煮３０ｍｉｎ，去离子水将其洗入１００ｍｌ容量瓶，再加入４．５ｍｌ２０％硝酸溶液和１０ｍｌ　ｐＨ为７的缓冲 溶液，调节供试品ｐＨ，去离子水定容；　（６）测定２－酮基－Ｌ－古龙酸中蛋白质含量：　分别移取１ｍｌ去离子水一份和供试品溶液两份于三支试管中，前两支试管加入５ｍｌ考马斯亮蓝试剂，第三支试管加入５ｍｌ去离子水，１２０ｍｉｎ内分别测定 三支试管中的溶液和去离子水在５９５ｎｍ处吸光度；吸光度的增加量ΔＡ↓［（５９５）］＝Ａ↓［２］－Ａ↓［１］－Ａ↓［３］＋Ａ↓［０］，其中Ａ↓［０］为去离子水的吸光度，Ａ↓［１］为１ｍｌ去离子水和５ｍｌ考马斯亮蓝Ｇ－２５０溶液的吸光度，Ａ↓［２］为１ｍｌ供试品和５ｍｌ考马斯亮蓝Ｇ－２５０溶液的吸光度，Ａ↓［３］为１ｍｌ供试品和５ｍｌ去离子水的吸光度；根据吸光度增加值...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：于霞，王雪，李春杰，陈宏权，敖志刚，董静，董淑清，符艳君，王凤杰，王彦春，
申请(专利权)人：东北制药总厂，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]