靶向STAT3蛋白Ser701磷酸化的抗原肽、抗体及其应用制造技术

本申请公开了靶向STAT3蛋白Ser701磷酸化的抗原肽及其应用。该抗原肽具有与SEQ ID NO.1～4所示的氨基酸序列、或与该序列具有相同功能的同源序列。应用该抗原肽制备的抗体能检测出细胞和组织中的STAT3蛋白Ser701磷酸化水平，有助于研究STAT3蛋白Ser701磷酸化的分子机制和生物学功能；为研究STAT3在细胞周期进展、自噬、凋亡、代谢、炎症、侵袭和血管生成等细胞信号通路中的作用提供帮助。本申请中提供了一种STAT3蛋白Ser701磷酸化抗体的制备方法，该方法操作简单，通过此方法制得的抗体特异性强、纯度高、稳定性好。稳定性好。稳定性好。

【技术实现步骤摘要】
靶向STAT3蛋白Ser701磷酸化的抗原肽、抗体及其应用


[0001]本申请属于STAT3蛋白磷酸化检测
，本申请公开了靶向STAT3蛋白Ser701磷酸化的抗原肽及其应用，具体而言涉及能够将肽作为抗原，制备靶向识别STAT3蛋白Ser701磷酸化的抗体及其作为检测STAT3蛋白Ser701磷酸化水平的应用。

技术介绍

[0002]信号传导及转录激活蛋白(signal transducer and activator of transcription，STAT)是一种具有DNA结合活性的蛋白，包括STAT1～6，其中，STAT3蛋白是STAT家族中最重要的成员之一，作为一个显著的核转录因子，其与超过1000个基因产物的表达有关。
[0003]STAT3蛋白在结构上可分为以下几个功能区段：N
‑
末端结构域、DNA结合域、卷曲螺旋结构域、SH2结构域、C
‑
末端转录激活结构域，其中SH2结构域是最保守也是对其功能最重要的区段。通过位于SH2和C端的转录激活结构域之间的保守Tyr705残基的磷酸化，从而介导2个STAT3分子之间的相互作用，形成同源二聚体。
[0004]蛋白质翻译后修饰对STAT3蛋白的活性调控至关重要，而磷酸化修饰为最主要的一种。STAT3 Tyr705位点磷酸化可被多种细胞因子和生长因子激活，包括利用IL
‑
6信号转导受体链gp130(如白介素
‑
6、抗癌素M、白介素
‑
11)或同二聚体细胞因子受体(如粒细胞集落刺激因子，G
‑
CSF)，以及通过蛋白酪氨酸激酶受体(如表皮生长因子，EGF)起作用。细胞因子与受体结合后，激活受体复合物上的特定位点酪氨酸残基磷酸化，STAT3蛋白的SH2结构域与特异性受体磷酸酪氨酸序列相互作用，将STAT3蛋白招募到受体信号复合物中，使STAT3蛋白的Tyr705残基磷酸化并从细胞膜上脱落。Tyr705磷酸化的STAT3在细胞质内形成具有DNA结合活性的同源二聚体，可以转移至细胞核内，与靶基因启动子序列的特定位点结合，参与靶基因的转录调控。此外，Ser727位点发生磷酸化可使STAT3转位至线粒体，能够进入线粒体与mtDNA结合调节基因转录表达，并且能增加缺血损伤下电子传递链复合酶活性，降低ROS的产生，增加ATP的生成，减少组织损伤。

技术实现思路

[0005]本申请专利技术人通过对STAT3蛋白结构进行深入研究，发现其第701位氨基酸Ser存在发生磷酸化的可能，而该位置若发生磷酸化可能对STAT3蛋白的经典信号通路激活产生影响。因此，发掘有效检测STAT3蛋白第701位丝氨酸磷酸化的相关技术和方法，对探索STAT3 Ser701磷酸化在细胞内的机制以及在动物体和人体内的生物学功能及相关药物开发等方面具有积极意义。为此，本申请实施例至少公开了以下技术方案：
[0006]第一方面，本申请实施例公开了一种抗原肽，所述抗原肽是模拟STAT3蛋白Ser701磷酸化的肽或其功能片段。该肽或其功能片段能够在体内产生免疫应答，进而产生一种能够特异性结合STAT3第701位丝氨酸磷酸化的抗体，从而利用该抗体能够有效检测细胞中STAT3蛋白的Ser701位点磷酸化水平，可以间接探究细胞生长、增殖、代谢、炎症等生物学过
程。
[0007]所述抗原肽具有靶向STAT3蛋白的Ser701磷酸化位点的免疫原性，其中，所述抗原肽为(I)～(IV)中的至少一项：
[0008](I).SEQ ID NO.1～4所示的氨基酸序列；
[0009](II).与(I)所述序列至少有75％相似性的氨基酸序列；
[0010](III).具有与(I)或(II)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸序列获得的氨基酸序列，且与(I)或(II)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；
[0011](IV).(I)、(II)或(III)所述肽或在其氨基酸序列中的部分或全部氨基酸残基处被修饰。
[0012]第二方面，一种抗原构建体，所述抗原构建体包含第一方面的抗原肽及用于负载或偶联所述第一方面的抗原肽的载体。
[0013]第三方面，本申请实施例还公开了第一方面所述的抗原肽及第二方面所述的抗原构建体的应用，所述应用包括如下至少一项：
[0014](1)制备STAT3蛋白的Ser701磷酸化特异性抗体；
[0015](2)制备STAT3蛋白的Ser701磷酸化相关疾病的疫苗；
[0016](3)免疫激活剂。
[0017]第四方面，本申请实施例公开了一种抗体，所述抗体与第一方面限定的抗原肽、或与第二方面所述的构建体进行免疫反应。
[0018]第五方面，本申请实施例公开了第四方面所述抗体的制备方法，包括将第一方面所述的抗原肽与第二方面所述的构建体进行动物免疫，收集抗血清和纯化的步骤。
[0019]第六方面，本申请实施例公开了一种ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒包括第四方面所述的抗体，所述ELISA试剂盒用于检测STAT3蛋白Ser701位点的磷酸化水平。
[0020]第七方面，本申请实施例公开了一种药物组合物，包括第四方面或所述的抗体或第五方面所述的制备方法得到的抗体，以及药学上可接受的辅料或者载体。
[0021]与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果之一：
[0022]本申请提供一种靶向STAT3蛋白Ser701磷酸化的抗原肽以及由此制得的抗体，有助于研究STAT3在细胞周期进展、自噬、凋亡、代谢、炎症、侵袭和血管生成等细胞信号通路中的作用，以及STAT3在肿瘤、代谢性疾病、炎症性肠病、心血管疾病等多种疾病中的作用机理,为临床疾病的治疗提供潜在的作用靶点；可将STAT3蛋白Ser701位点磷酸化抗体运用于肿瘤的预后判定中。
附图说明
[0023]图1为本申请实施例提供的STAT3蛋白Ser701位点磷酸化质谱鉴定图。
[0024]图2为本申请实施例提供的磷酸化(上图)抗原肽和非磷酸化(下图)抗原肽HPLC纯度测定结果图。
[0025]图3为本申请实施例提供的不同STAT3蛋白突变体的表达质粒电泳图(a)、测序比对图(b)以及自制抗体用于检测细胞内的STAT3蛋白本底和IL
‑
6刺激时的Ser701位点磷酸化信号的WesternBlot检测图(c)；
[0026]图3a中，从左至右的泳道依次为Marker、pCDNA3.1
‑
GFP、pCDNA3.1
‑
GFP
‑
STAT3
‑
FL和pCDNA3.1
‑
GFP
‑
STAT3
‑
S701A；图3b中为pCDNA3.1
‑
GFP
‑
STAT3
‑
FL和pCDNA3.1
‑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分离的抗原肽，所述抗原肽具有靶向STAT3蛋白的Ser701磷酸化位点的免疫原性，其中，所述抗原肽为(I)～(IV)中的至少一项：(I)SEQ ID NO.1～4所示的氨基酸序列；(II)与(I)所述序列至少有75％相似性的氨基酸序列；(III)具有与(I)或(II)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸序列获得的氨基酸序列，且与(I)或(II)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；(IV)(I)、(II)或(III)所述抗原肽或在其氨基酸序列中的部分或全部氨基酸残基处被修饰。2.一种抗原构建体，所述抗原构建体包含权利要求1所述的抗原肽及用于负载或偶联权利要求1所述的抗原肽的载体。3.根据权利要求2所述的抗原构建体，其中，所述载体是脂质体。4.根据权利要求2所述的抗原构建体，其中，所述载体选自匙孔槭血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵白蛋白(OVA)、牛甲状腺球蛋白(THY)、灭活百日咳毒素、B群脑膜炎球菌外膜蛋白、绿脓杆菌外毒素A、霍乱毒素B亚单位、细菌外膜蛋白、大肠杆菌热敏感肠毒素、肺炎球菌溶血素、淋球菌菌毛蛋白和革兰氏阴性菌的脂多糖中的一种。5.权利要求1所述的抗原肽、权利要求2所述的抗原构建体的应用，所述应用包括如下至少一项：(1)用作制备STAT3蛋白的Ser701磷酸化特异性抗体；(2)用作制备STAT3蛋白的Ser701磷酸化相关疾病的疫苗；(3)用作免疫激活剂。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：仝晶晶，王志华，朱双蝶，陈琴，吕舰，
申请(专利权)人：华中师范大学，
类型：发明
国别省市：