通用型多功能植物表达载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种通用型多功能植物表达载体及其构建方法和应用，通用型多功能植物表达载体包括通用型多功能植物表达载体pRC1.4和/或通用型多功能植物表达载体pRC1.24，pRC1.4包含完整的AtUBQ10pro

【技术实现步骤摘要】
通用型多功能植物表达载体及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及植物基因工程与分子生物学
，具体涉及一种通用型多功能植物表达载体及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]植物基因工程技术克服了植物有性杂交的限制，通过将外源基因导入植物来改良植物性状，培育优质高产作物新品种，为植物的遗传改良开拓了广阔的前景。在基因克隆、基因功能分析以及基因转化等分子生物学的研究与应用过程中，载体构建是常用的技术手段，采用适当的表达载体及构建方法则会取得事半功倍的效果。尽管目前已公开了多种植物表达载体，但对于通用型多功能植物表达载体的开发仍相对缓慢，还不能满足转基因产业化不断扩大的需求。
[0003]双分子荧光互补技术(BiFC)是将荧光蛋白在合适的位点截断，分别构建于两个表达载体中，再借助融合于其上的目标蛋白间的相互作用，彼此靠近，重新形成完整的具有活性的荧光蛋白，从而表征出蛋白间的相互作用，并指示出其在细胞中的相互作用位点。BiFC技术简单直观，可视性强，被广泛应用于植物体内或体外蛋白质相互作用的检测。现有植物BiFC技术中的表达载体功能单一，检测效率低下，因此需要开发更高效的多功能植物表达载体，以提高检测效率和准确度。
[0004]在真核细胞中，亚细胞定位是了解目标蛋白在细胞中参与生理过程的重要手段，为系统地理解蛋白质的作用机制提供研究方向。细胞器荧光标记系能精确指示出目标蛋白的具体位置，在植物亚细胞定位中发挥重要作用。然而，目前对于植物细胞器荧光标记系的开发仍相对缓慢，迫切需要开发新型细胞器荧光标记系，以弥补现有技术中存在的问题及缺陷。
[0005]综上所述，开发通用型多功能植物表达载体，不仅有助于提升实验效率、提高检测精度，也有助于植物基因功能的挖掘，在植物基因工程与分子生物学领域中具有很好的应用前景。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种通用型多功能植物表达载体及其构建方法和应用，以有效提升实验效率，提高检测精度，为植物遗传转化、蛋白质亚细胞定位及蛋白质相互作用分析提供有力的工具。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：
[0008]本专利技术提供了一种通用型多功能植物表达载体,包括通用型多功能植物表达载体pRC1.4和/或通用型多功能植物表达载体pRC1.24，所述通用型多功能植物表达载体pRC1.4为pRI201
‑
AN进行HindIII和AvrII双酶切，保留含有T
‑
DNA片段RB端侧翼序列、大肠杆菌和农杆菌的复制起点及其NPTIII选择标记基因序列的线性载体骨架与含有T
‑
DNA片段LB端侧翼序列的人工合成片段RC1.4进行无缝连接，重组而成的环状载体，所述RC1.4由
AtUBQ10pro
‑
MCS
‑
3xFLAG
‑
Linker
‑
nYFP
‑
HSPt基因表达盒、AtACTIN11pro
‑
AtH2B
‑
mRFP1
‑
NOSt基因表达盒、NOSpro
‑
HYG
‑
NOSt基因表达盒依次串联，并在串联序列5
’
端和3
’
端分别添加含有15bp与pRI201
‑
AN线性骨架特异性重组的接头序列的HindIII和AvrII酶切位点而成；其中，AtUBQ10pro
‑
MCS
‑
3xFLAG
‑
Linker
‑
nYFP
‑
HSPt基因表达盒由拟南芥启动子AtUBQ10pro、带有KpnI和BamHI特异性酶切位点的多克隆位点MCS、多肽标签3xFLAG、连接肽Linker GGGGSGGGGSGGGGS编码序列、荧光蛋白YFP的N端nYFP序列以及热激蛋白终止子HSPt依次连接组成，AtACTIN11pro
‑
AtH2B
‑
mRFP1
‑
NOSt基因表达盒由拟南芥启动子AtACTIN11pro、拟南芥组蛋白AtH2B编码框、红色荧光标签mRFP1及胭脂碱合成酶终止子NOSt依次连接组成，NOSpro
‑
HYG
‑
NOSt基因表达盒由胭脂碱合成酶基因启动子NOSpro、潮霉素抗性标记HYG编码框及胭脂碱合成酶终止子NOSt依次连接组成；所述通用型多功能植物表达载体pRC1.24为pRI201
‑
AN进行HindIII和AvrII双酶切，保留含有T
‑
DNA片段RB端侧翼序列、大肠杆菌和农杆菌的复制起点及其NPTIII选择标记基因序列的线性载体骨架与含有T
‑
DNA片段LB端侧翼序列的人工合成片段RC1.24进行无缝连接，重组而成的环状载体，所述RC1.24由AtUBQ10pro
‑
MCS
‑
4xMYC
‑
Linker
‑
cYFP
‑
HSPt基因表达盒、AtACTIN11pro
‑
AtH2B
‑
TagBFP
‑
NOSt基因表达盒、NOSpro
‑
NPTII
‑
NOSt基因表达盒依次串联，并在串联序列5
’
端和3
’
端分别添加含有15bp与pRI201
‑
AN线性骨架特异性重组的接头序列的HindIII和AvrII酶切位点而成，其中，AtUBQ10pro
‑
MCS
‑
4xMYC
‑
Linker
‑
cYFP
‑
HSPt基因表达盒由拟南芥启动子AtUBQ10pro、带有KpnI和BamHI特异性酶切位点的多克隆位点MCS、多肽标签4xMYC、连接肽Linker GGGGSGGGGSGGGGS编码序列、荧光蛋白YFP的C端cYFP序列以及热激蛋白终止子HSPt依次连接组成，AtACTIN11pro
‑
AtH2B
‑
TagBFP
‑
NOSt基因表达盒由南芥启动子AtACTIN11pro、拟南芥组蛋白AtH2B编码框、蓝色荧光标签TagBFP及胭脂碱合成酶终止子NOSt依次连接组成，NOSpro
‑
NPTII
‑
NOSt基因表达盒由胭脂碱合成酶基因启动子NOSpro、卡那霉素抗性标记NPTII编码框及胭脂碱合成酶终止子NOSt依次连接组成。
[0009]优选地，所述RC1.4的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，RC1.24的核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示。
[0010]优选地，所述通用型多功能植物表达载体pRC1.4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通用型多功能植物表达载体，其特征在于，包括通用型多功能植物表达载体pRC1.4和/或通用型多功能植物表达载体pRC1.24；其中，所述通用型多功能植物表达载体pRC1.4为pRI201
‑
AN进行HindIII和AvrII双酶切，保留含有T
‑
DNA片段RB端侧翼序列、大肠杆菌和农杆菌的复制起点及其NPTIII选择标记基因序列的线性载体骨架与含有T
‑
DNA片段LB端侧翼序列的人工合成片段RC1.4进行无缝连接，重组而成的环状载体，所述RC1.4由AtUBQ10pro
‑
MCS
‑
3xFLAG
‑
Linker
‑
nYFP
‑
HSPt基因表达盒、AtACTIN11pro
‑
AtH2B
‑
mRFP1
‑
NOSt基因表达盒、NOSpro
‑
HYG
‑
NOSt基因表达盒依次串联，并在串联序列5
’
端和3
’
端分别添加含有15bp与pRI201
‑
AN线性骨架特异性重组的接头序列的HindIII和AvrII酶切位点而成；其中，AtUBQ10pro
‑
MCS
‑
3xFLAG
‑
Linker
‑
nYFP
‑
HSPt基因表达盒由拟南芥启动子AtUBQ10pro、带有KpnI和BamHI特异性酶切位点的多克隆位点MCS、多肽标签3xFLAG、连接肽Linker GGGGSGGGGSGGGGS编码序列、荧光蛋白YFP的N端nYFP序列以及热激蛋白终止子HSPt依次连接组成，AtACTIN11pro
‑
AtH2B
‑
mRFP1
‑
NOSt基因表达盒由拟南芥启动子AtACTIN11pro、拟南芥组蛋白AtH2B编码框、红色荧光标签mRFP1及胭脂碱合成酶终止子NOSt依次连接组成，NOSpro
‑
HYG
‑
NOSt基因表达盒由胭脂碱合成酶基因启动子NOSpro、潮霉素抗性标记HYG编码框及胭脂碱合成酶终止子NOSt依次连接组成；所述通用型多功能植物表达载体pRC1.24为pRI201
‑
AN进行HindIII和AvrII双酶切，保留含有T
‑
DNA片段RB端侧翼序列、大肠杆菌和农杆菌的复制起点及其NPTIII选择标记基因序列的线性载体骨架与含有T
‑
DNA片段LB端侧翼序列的人工合成片段RC1.24进行无缝连接，重组而成的环状载体，所述RC1.24由AtUBQ10pro
‑
MCS
‑
4xMYC
‑
Linker
‑
cYFP
‑
HSPt基因表达盒、AtACTIN11pro
‑
AtH2B
‑
TagBFP
‑
NOSt基因表达盒、NOSpro
‑
NPTII
‑
NOSt基因表达盒依次串联，并在串联序列5
’
端和3
’
端分别添加含有15bp与pRI201
‑
AN线性骨架特异性重组的接头序列的HindIII和AvrII酶切位点而成，其中，AtUBQ10pro
‑
MCS
‑
4xMYC
‑
Linker
‑
cYFP
‑
HSPt基因表达盒由拟南芥启动子AtUBQ10pro、带有KpnI和BamHI特异性酶切位点的多克隆位点MCS、多肽标签4xMYC、连接肽Linker GGGGSGGGGSGGGGS编码序列、荧光蛋白YFP的C端cYFP序列以及热激蛋白终止子HSPt依次连接组成，AtACTIN11pro
‑
AtH2B
‑
TagBFP
‑
NOSt基因表达盒由南芥启动子AtACTIN11pro、拟南芥组蛋白AtH2B编码框、蓝色荧光标签TagBFP及胭脂碱合成酶终止子NOSt依次连接组成，NOSpro
‑
NPTII
‑
NOSt基因表达盒由胭脂碱合成酶基因启动子NOSpro、卡那霉素抗性标记NPTII编码框及胭脂碱合成酶终止子NOSt依次连接组成。2.根据权利要求1所述的通用型多功能植物表达载体，其特征在于，RC1.4的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，RC1.24的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。3.根据权利要求2所述的通用型多功能植物表达载体，其特征在于，所述通用型多功能植物表达载体pRC1.4的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述通用型多功能植物表达载体pRC1.24的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。4.权利要求1所述的通用型多功能植物表达载体的构建方法，其特征在于，通用型多功能植物表达载体pRC1.4的构建方法包括如下：对pRI201
‑
AN进行HindIII和AvrII双酶切，保留含有T
‑
DNA片段RB端侧翼序列、大肠杆菌和农杆菌的复制起点及其NPTIII选择标记基因序列的线性载体骨架；用重组酶将所述线性载体骨架与含有T
‑
DNA片段LB端侧翼序列的人工合成片段...

【专利技术属性】
技术研发人员：委刚，陈新龙，何光华，张莹莹，徐海玲，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：