一种DNA装配分子机器及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种DNA装配分子机器及其应用，涉及分子生物技术领域。DNA装配分子机器包括掌结构域、2个末端插入结构域、拇指结构域、手指结构域和外切酶活性结构域。DNA装配分子稳定性好，适用于等温扩增。此外，上述DNA装配分子及其突变体具备在多种金属离子、不同温度下的DNA组装功能，可应用于纳米孔测序、单分子测序、RCA建库、环境检测和体外诊断。环境检测和体外诊断。环境检测和体外诊断。

【技术实现步骤摘要】
一种DNA装配分子机器及其应用


[0001]本专利技术涉及分子生物
，具体而言，涉及一种DNA装配分子机器及其应用。

技术介绍

[0002]DNA测序技术的开发对于近代生物探索、疾病诊断及人类溯源均具有重要的意义。随着测序技术的进步，从扩增后的间接测序向原位单分子测序发展。无论是Pacbio tSMS单分子荧光测序技术还是ONT的电生理测序技术，测序长度、准确率和效率都严重依赖于控制DNA移动与装配的分子马达。其中，Pacbio主要利用和华大智造的DNB
‑
SEQ技术都依赖于phi29聚合酶的滚环扩增，在该技术中需要phi29聚合酶具备较高的热稳定性和活性。而在纳米孔测序中，现有的聚合酶的活性过高又使得DNA易位过孔速率过快，很难将DNA易位穿孔的时间从10us提升到100us，而对DNA装配分子机器的要求又需要其具备较高的耐盐性能，需要耐受300mM以上的盐浓度。
[0003]目前已有的phi29聚合酶专利对其耐热性和耐盐性都分别做了改造，如专利WO2021248757A1中通过73个点突变提高了商业化phi29聚合酶的热稳定性，其中突变组合M97T、Y224K和E515S的热稳定Tm值从48.5℃提高到50.8℃，可见对商业化phi29聚合酶的改造不仅难度大，而且很难显著改变酶的特性。在专利CN201910778360中公开了一种新型耐盐聚合酶，相比于phi29聚合酶和Taq DNA聚合酶，该专利中的聚合酶能够耐受氯化钠的拐点为300mM，大于500Mm以后失去活性，而且该聚合酶在钙离子、锌离子和锂离子条件下易失活。因此，进一步设计新型的DNA装配分子机器来提高耐盐性、热稳定性以及对重金属离子的耐受性是本领域需要解决的技术瓶颈。
[0004]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种DNA装配分子机器及其应用以解决上述技术问题。
[0006]本专利技术是这样实现的：
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种500
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1000个氨基酸组成的DNA装配分子机器，其包括掌结构域、2个末端插入结构域、拇指结构域、手指结构域和外切酶活性结构域；其中，掌结构域由150
‑
220个氨基酸组成，拇指结构域由40
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70个氨基酸组成，手指结构域由30
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45个氨基酸构成α螺旋结构，外切酶活性结构域由150
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220个氨基酸组成；2个末端插入结构域包括末端插入结构域1和末端插入结构域2，末端插入结构域1由50
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150个氨基酸组成，末端插入结构域2由20
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70个氨基酸组成；
[0008]DNA装配分子机器具有如下功能：
[0009]通过氨基酸侧链与核苷酸相互作用的能力；且DNA装配分子机器具有装载和/或连接DNA分子的能力。
[0010]DNA装配分子可以通过氨基酸侧链与游离的核苷酸的碱基相互作用，或者与磷酸盐骨架相互作用。在一种可选的实施方式中，上述DNA装配分子具有装载和/或连接引物链、
模板链的作用。
[0011]由掌结构域、2个末端插入结构域、拇指结构域、手指结构域和外切酶活性结构域组成的DNA装配分子机器具有良好的稳定性，可以用于等温扩增。本专利技术提供的DNA装配分子及其突变体具备在多种金属离子、不同温度下的DNA组装功能，可应用于纳米孔测序、单分子测序、RCA建库、环境检测和体外诊断。尤其在高盐浓度下，具有远优于现有DNA聚合酶的扩增活性，可以通过提高盐浓度，延长DNA易位穿孔的时间，从而提高单分子测序的准确率，极大程度上减少关键测序信息的丢失。
[0012]在一种可选的实施方式中，上述掌结构域由150
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200个氨基酸组成，或者由160
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220个氨基酸组成，或者由180
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220个氨基酸组成。
[0013]在一种可选的实施方式中，上述拇指结构域由40个、45个、50个、55个、60个、65个或70个氨基酸组成，在外切酶活性结构域与掌结构域之间形成长度为30
‑
45埃的结构域，防止DNA装配过程中酶与DNA的解离。
[0014]在一种可选的实施方式中，上述手指结构域由30个、32个、36个、38个、40个或45个氨基酸构成α螺旋结构，该段结构主要功能是结合DNA，并协助外切酶活性的功能。
[0015]在一种可选的实施方式中，上述外切酶活性结构域由150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个或220个氨基酸组成。
[0016]末端插入结构域包括末端插入结构域1和末端插入结构域2，末端插入结构域1由50
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150个氨基酸组成，末端插入结构域2由20
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70个氨基酸组成，实现模板链与非模板链的有效分离，有助于有效的链位移和连续性。
[0017]在本专利技术应用较佳的实施方式中，DNA装配分子机器的各结构域的氨基酸类型选自如下至少一种：天然氨基酸、非天然氨基酸、经修饰的天然氨基酸、经修饰的非天然氨基酸。
[0018]天然氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、色氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、胱氨酸，或者上述氨基酸的C1
‑
C4烷基酯。
[0019]非天然氨基酸选自对
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乙酰基
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苯丙氨酸、对
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乙炔基
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苯丙氨酸、对
‑
炔丙基氧基苯丙氨酸、对
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叠氮基
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苯丙氨酸、β
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丙氨酸(βAla)、6
‑
氨基己酸(Aca)以及一端为氨基、一端为羧基的三缩四乙二醇(Teg，NH2‑
CH2CH2‑
O
‑
CH2CH2‑
O
‑
CH2CH2‑
O
‑
CH2CH2‑
COOH)、NAEK、Lys
‑
azido、或其它含有双吖丙啶、叠氮结构中的一种、两种或三种。
[0020]上述修饰选自：糖基化、磷酸化、泛素化、S
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亚硝基化、甲基化、N
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乙酰化、琥珀酰化、羟基化、脂质化和聚异戊二烯化中的至少一种。
[0021]在一种可选的实施方式中，甲基化选自N
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甲基化或O
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甲基化；
[0022]在一种可选的实施方式中，糖基化选自ADP核糖基化。
[0023]在本专利技术应用较佳的一个实施方式中，掌结构域上有两段形成β折叠片的氨基酸序列。
[0024]两段形成β折叠片的氨基酸序列分别为：EWKFKMV和ATAT；
[0025]对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DNA装配分子机器，其特征在于，其包括掌结构域、2个末端插入结构域、拇指结构域、手指结构域和外切酶活性结构域；其中，所述掌结构域由150
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220个氨基酸组成，所述拇指结构由40
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70个氨基酸组成，所述手指结构域由30
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45个氨基酸构成α螺旋结构，所述外切酶活性结构域由150
‑
220个氨基酸组成；所述2个末端插入结构域包括末端插入结构域1和末端插入结构域2，所述末端插入结构域1由50
‑
150个氨基酸组成，所述末端插入结构域2由20
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70个氨基酸组成；所述DNA装配分子机器具有如下功能：通过氨基酸侧链与核苷酸相互作用的能力；且所述DNA装配分子机器具有装载和/或连接DNA分子的能力。2.根据权利要求1所述的DNA装配分子机器，其特征在于，所述DNA装配分子机器的各结构域的氨基酸类型选自如下至少一种：天然氨基酸、非天然氨基酸、经修饰的天然氨基酸、经修饰的非天然氨基酸；其中，所述修饰选自：糖基化、磷酸化、泛素化、S
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亚硝基化、甲基化、N
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乙酰化、琥珀酰化、羟基化、脂质化和聚异戊二烯化中的至少一种；优选地，所述甲基化选自N
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甲基化或O
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甲基化；优选地，所述糖基化选自ADP核糖基化。3.根据权利要求1
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2任一项所述的DNA装配分子机器，其特征在于，所述掌结构域上有两段形成β折叠片的氨基酸序列；优选地，所述两段形成β折叠片的氨基酸序列分别为：EWKFKMV和ATAT；优选地，所述拇指结构域包括形成α螺旋结构的序列，所述拇指结构域上形成α螺旋结构的氨基酸序列如下：DPNDFTEEEIKRKNI。4.根据权利要求1或2所述的DNA装配分子机器，其特征在于，所述DNA装配分子机器包括：(a)：由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列进行突变获得的突变体，其中，所述突变体与DNA相互作用的位点上至少一个的氨基酸被取代或被修饰；和/或，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中插入一个或多个氨基酸；和/或，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中缺失一个或多个氨基酸；和/或，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列进行侧链修饰；或(b)：由SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列进行突变获得的突变体，其中，所述突变体的突变位置通过如下方式确定：将所述突变体与SEQ ID NO：1所示的序列比对，所述突变体的突变位置对应于所述SEQ ID NO：1所示的序列的功能位点；所述突变体在突变位置的氨基酸中的至少一个被取代、缺失、插入或者被修饰。5.根据权利要求4所述的DNA装配分子机器，其特征在于，所述(a)：SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中被取代或修饰的氨基酸是D12,E14,T15,Y60,H62,N63,F66,D67,F70,V94,S123,L124,D146,Y149,D170,D257,V258,S260,Y262,T365,I372,W374,K378,K379,R338,K392,L393,N396,S397,Y399,G400,F402,K428,E429,T443,D465,D467,K507,Y509和K547中的至少一个；
所述(b)：所述功能位点是SEQ ID NO：1所示序列的D12,E14,T15,Y60,H62,N63,F66,D67,F70,V94,S123,L124,D146,Y149,D170,D257,V258,S260,Y262,T365,I372,W3...

【专利技术属性】
技术研发人员：李毅，刘荣辉，王卓飞，戴菁，
申请(专利权)人：南方科技大学，
类型：发明
国别省市：