一种高通量选育高CO2耐性高油脂含量诱变藻种的方法，包括以下步骤：（1）对野生藻进行常压室温等离子体诱变；（2）暗培养防止光修复；（3）对突变株进行分离纯化与低pH压力选择；（4）利用尼罗红荧光染色筛选高油脂含量藻株；（5）进行扩大培养与高CO2压力选择：（6）多代连续培养筛选出具有遗传稳定性的藻株。本发明专利技术将ARTP技术、尼罗红荧光染色筛选及细胞分离纯化等技术结合在一起，用于废气CO2固定和生物柴油生产藻株的定向高通量筛选，将初筛、终筛和遗传稳定性检测等整合在一个工作周期中，筛选速度快，结果稳定，扩大了可用的微藻种质资源，对丰富能源微藻库，缓解全球变暖和能源危机有显著的意义。的意义。的意义。
【技术实现步骤摘要】
高通量选育高CO2耐性高油脂含量诱变藻种的方法
[0001]本专利技术涉及一种微藻藻株人工诱变选育的方法，实现具有高CO2耐性高油脂含量特征突变藻株的快速大量筛选，属于微生物工程
技术介绍
[0002]筛选具有耐受高浓度CO2和高油脂含量特点的候选藻株是利用微藻固定CO2和藻基生物柴油商业化的关键步骤之一。实际生产所用微藻主要是从自然界直接分离野生藻株。然而，野生藻株往往后代性状单一，驯化改良性状潜力小、速度慢、对环境适应性差而且容易退化。此外，筛选出的微藻藻种集中于极少数类群，自然界丰富的微藻藻种资源利用度极低。因此，需要新的育种技术定向选育高CO2耐性高油脂含量藻种，扩大微藻藻种的可筛选范围。
[0003]诱变因其可在较短育种时间内获得野生株所不具有的种质特征，已成为微生物育种的重要技术。除了常见的化学诱变、紫外线、半导体激光、超声波等诱变育种技术，常温常压等离子体诱变则是一种新兴的诱变育种工具。因其设备操作简单、安全性高、突变强度高、突变库容大等优点，近几年得到广泛应用。
[0004]不过，常温常压等离子体诱变在微藻选育领域中的应用报道较少，特别是在定向选育高CO2耐性高油脂含量藻种方面尚无成熟案例可借鉴。
技术实现思路
[0005]本专利技术针对现有高CO2耐性高油脂含量藻种选育技术存在的不足，提出一种高通量选育高CO2耐性高油脂含量诱变藻种的方法，将常压室温等离子诱变、环境压力选择、尼罗红荧光染红筛选以及96孔板单克隆细胞分离纯化和高通量筛选结合，具有高通量快速获得高CO2耐性高油脂含量藻株的特点。
[0006]本专利技术的高通量选育高CO2耐性高油脂含量诱变藻种的方法，具体包括以下步骤：
[0007](1)常压室温等离子体诱变：
[0008]将处于对数生长期的野生藻株调整至浓度为106～107个细胞mL
‑1，将藻液均匀涂布在载片表面，并将载片放入常压室温等离子体诱变育种仪操作室的凹槽中，并将装有磷酸盐缓冲溶液的离心管固定在凹槽下方(凹槽下有固定离心管的位置)，进行诱变处理；诱变完成后，载片掉入离心管中。
[0009]所述诱变处理过程的主要参数如下：
[0010]处理距离(即常温常压诱变仪中等离子体的IIS发射源与载片之间的距离)为2mm，电源输出功率为50～200W，气体流量G为1～20SLM，在10分钟后开始诱变处理，辐照时间设置为5～120秒。
[0011](2)暗培养：
[0012]诱变完成后，将离心管从诱变育种仪中取出，进行振荡，使附着在载片上的藻液被洗脱下来，随后将离心管置于黑暗环境中，防止诱变后的微藻进行光修复。
[0013]所述离心管振荡1分钟，置于黑暗环境中24小时。
[0014](3)分离纯化与低pH压力选择：
[0015]暗培养完成后，振荡离心管使藻液混合均匀，将藻液中的每个藻细胞分离至细胞培养板(96孔板)的微孔内，然后密封，防止液体蒸发；将细胞培养板放置于在恒温的人工培养箱中保持连续光照，直至有微孔变绿；将所有变绿的微孔中的藻株分别无菌接种到新鲜培养基中，在连续光照条件下培养直至待选突变株的培养基变绿，未变绿的待选突变株舍弃。
[0016]所述新鲜培养基pH预先调整为5。
[0017]所述藻细胞分离可采用以下两种方案之一：
[0018]①
取振荡均匀的藻液用pH5的新鲜培养基连续稀释，直至藻细胞浓度达到每50μL 0.8个；前后将200μL pH5的新鲜培养基和50μL稀释的藻液加入到细胞培养板的微孔内；
[0019]②
将单个藻细胞分离至细胞培养板的不同微孔中(利用流式细胞仪或其它具有自动分离单个细胞功能的仪器)，微孔中预先加入pH5的新鲜培养基。
[0020]所述培养基可用采用本领域常用BG11、SE等微藻培养基。
[0021](4)高油脂含量藻株的筛选：
[0022]将变绿的待测藻液稀释至106～107个细胞mL
‑1，将待测藻液与尼罗红溶液按950μL：50μL的比例置于离心管中进行染色，染色在避光条件下进行；完成染色后将混合液体转移至细胞培养板中，振荡后检测激发波长为528nm，发射波长为576nm时在750nm处的荧光强度(在酶标仪中检测)，出发野生株也进行相同的培养、荧光发色和测量；从突变株中筛选出相对荧光强度出油脂含量最高的藻株，筛选比例为待测藻株数的5
‑
10％；如相对荧光强度大于1的突变株比例较少，可适当降低筛选比例。
[0023]所述振荡时间为2分钟。
[0024]所述相对荧光强度按以下公式计算：
[0025]相对荧光强度＝藻株中性脂荧光强度/野生株中性脂荧光强度。
[0026](5)扩大培养与高CO2压力选择：
[0027]在光生物反应器中加入新鲜培养基至工作容积，并选取筛选出的高油脂含量突变株细胞无菌接种到光生物反应器中，放置于恒温的人工气候室中连续培养5～10天；制生长曲线，将没有明显的对数生长期，或虽有对数生长期但比生长速率低于0.3d
‑1的突变株筛除。
[0028]所述光生物反应器，为微藻培养工艺常规使用的密封式柱状、管状或平板状光生物反应器。
[0029]所述连续培养过程为：
[0030]培养待选突变株初始生物质浓度为50～100mg L
‑1，提供连续照明，光生物反应器表面光照强度为60～150μmol m
‑2s
‑1，曝气使用富CO2空气；培养时间为5～10天，培养结束时检测生物质浓度，绘制其生长曲线。
[0031]观察待选突变株生长曲线，如果没有明显的对数生长期，或虽有对数生长期但比生长速率低于0.3d
‑1，则认为其生长受到高浓度CO2的抑制，舍弃该突变株。
[0032]所述富CO2空气为中额外添加空气混合制得或含CO2废气，CO2的体积浓度为5％～20％。
[0033](6)遗传稳定性检测与筛选：
[0034]将筛选出的突变藻株按步骤(5)所述培养过程连续培养5代，每代检测生物质浓度和油脂含量。检测生物质浓度和油脂含量的显著性差异是利用单因素方差分析(ANOVA)和Duncan检验(p<0.05)分析检测的结果得出，将生物质浓度和油脂含量显著下降的待选突变株予以舍弃。
[0035]本专利技术筛选出的突变藻株主要用于废气CO2固定和生物柴油生产的科学研究和生产实践中。与传统微藻选育技术相比，本专利技术主要特点和有益效果为：
[0036](1)为定向选育，所筛选的藻株专门用于废气CO2固定和生物柴油生产。
[0037](2)为高通量筛选，条件请允许时可通过一次诱变可筛选出数百株符合要求的突变株。
[0038](3)将初筛、终筛和遗传稳定性检测等结合在一起，筛选速度快，只需要一个周期就可完成筛选工作，不需要反复筛选。
[0039](4)可采用低CO2耐性的非富油野生藻株作为出发株本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种高通量选育高CO2耐性高油脂含量诱变藻种的方法，其特征是，包括以下步骤：(1)常压室温等离子体诱变：将处于对数生长期的野生藻株调整至浓度为106～107个细胞mL
‑1，将藻液均匀涂布在载片表面，并将载片放入常温常压诱变仪操作室的凹槽中，并将装有磷酸盐缓冲溶液的离心管固定在凹槽下方，进行诱变处理；诱变完成后，载片掉入离心管中；(2)暗培养：诱变完成后，将离心管从诱变仪中取出，进行振荡，使附着在载片上的藻液被洗脱下来，随后将离心管置于黑暗环境中，防止诱变后的微藻进行光修复；(3)分离纯化与低pH压力选择：暗培养完成后，将离心管振荡使藻液混合均匀，将藻液中的每个藻细胞分离至细胞培养板的微孔内，然后密封，防止液体蒸发；将细胞培养板放置于在恒温的人工培养箱中保持连续光照，直至有微孔变绿；将所有变绿的微孔中的藻株分别无菌接种到新鲜培养基中，在连续光照条件下培养直至待选突变株的培养基变绿，未变绿的待选突变株舍弃；(4)高油脂含量藻株的筛选：将变绿的待测藻液稀释至106～107个细胞mL
‑1，将待测藻液与尼罗红溶液按950μL：50μL的比例置于离心管中进行染色，染色在避光条件下进行；完成染色后将混合液体转移至细胞培养板中，振荡后检测激发波长为528nm，发射波长为576nm时在750nm处的荧光强度，出发野生株也进行相同的培养、荧光发色和测量；从突变株中筛选出相对荧光强度出油脂含量最高的藻株，筛选比例为待测藻株数的5
‑
10％；(5)扩大培养与高CO2压力选择：在光生物反应器中加入新鲜培养基至工作容积，并选取筛选出的高油脂含量突变株细胞无菌接种到光生物反应器中，放置于恒温的人工气候室中连续培养5～10天；制生长曲线，将没有明显的对数生长期，或虽有对数生长期但比生长速率低于0.3d
‑1的突变株筛除；(6)遗传稳定性检测与筛选：将筛选出的突变藻株按步骤(5)所述培养过程连续培养5代，每代检测生物质浓度和油脂含量，将生物质浓度和油脂含量显著下降的待选突变株予以...
【专利技术属性】
技术研发人员：祁峰，母锐敏，马桂霞，安余梁，
申请(专利权)人：山东建筑大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。