一种促进鹰嘴豆结瘤的木垒根瘤菌及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种能够促进鹰嘴豆结瘤固氮的根瘤菌新物种木垒根瘤菌，于2022年8月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No.62640。所述根瘤菌菌株具有结瘤率高和固氮能力强的特性；接种所述根瘤菌对鹰嘴豆的地上部分生物量有显著影响，鹰嘴豆植株鲜重增加了22.09％，显著促进了植物的生长。因此，该菌株为生产鹰嘴豆微生物肥料提供了重要的根瘤菌资源。根瘤菌资源。

【技术实现步骤摘要】
Rhizobium muleienseTRM96647于2022年7月27日和2022年8月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏号分别为GDMCC NO. 62650和GDMCC NO. 62640，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0008]本专利技术提供一种固氮微生物制剂，含所述根瘤菌Rhizobium muleiense TRM96647菌株和/或其菌悬液。菌悬液的OD值为0.8
‑
1.2，菌悬液的发酵条件为25℃，pH 7.0，YMA培养基。将两菌株菌悬液分别接种到鹰嘴豆植株上，鹰嘴豆的株高、根重量、地上部分重量、根瘤重量等都获得了明显的提升，因此该菌株适用于鹰嘴豆的栽培生产，特别适用于盐碱地区鹰嘴豆的栽培生产，有利于促进植株结瘤固氮，增加植株的氮素营养，促进鹰嘴豆优质高产。
[0009]本专利技术具有以下有益效果：本专利技术是从鹰嘴豆根瘤中分离并筛选出的结瘤根瘤菌菌株，所述根瘤菌菌株具有结瘤率高和固氮能力强的特性；接种根瘤菌TRM96647对鹰嘴豆的生物量有显著影响，对鹰嘴豆植株鲜重增加了22.09％，显著促进了植物的生长。该菌株为生产鹰嘴豆微生物肥料提供了重要的根瘤菌资源。
[0010]附图说明
[0011]图1奇台根瘤菌TRM95796
T
和木垒根瘤菌TRM96647
T
的电镜照片；图2 A 菌株TRM95796
T
和TRM96647
T
基于16S rRNA基因邻接法系统进化树。<br/>[0012]图2B 菌株TRM95796
T
和TRM96647
T
基于16S rRNA基因最大简约法系统进化树。
[0013]图2C 菌株TRM95796
T
和TRM96647
T
基于16S rRNA基因最大似然法系统进化树。
[0014]图3菌株TRM95796
T
和TRM96647
T 全基因组（TYGS）系统进化树图4菌株TRM95796
T
和TRM96647
T 管家（recA
‑
atpD）基因邻接法系统进化树图5菌株TRM95796
T
和TRM96647
T 极性脂类型（PE：磷脂酰乙醇胺；PIM：磷脂酰肌醇甘露糖苷；DPG：双磷脂酰甘油；PI：磷脂酰肌醇；L1，L2：未知化合物）图6接种菌株TRM95796
T
和TRM96647
T
鹰嘴豆盆栽试验结果。
[0015]图7接种菌株TRM95796
T
和TRM96647
T
大田试验鹰嘴豆长势图。
具体实施方式
[0016]下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本专利技术，但并不是对本专利技术的限制，仅仅作示例说明。
[0017]实施例一、奇台根瘤菌TRM95796和木垒根瘤菌TRM96647的来源与分离培养从新疆奇台县和木垒县的鹰嘴豆种植地采集新鲜饱满的根瘤，根瘤样品采集后用流水清洗表面，用75%乙醇和2%次氯酸钠溶液分别进行表面消毒，再用无菌水反复冲洗，再用消过毒的刀子将单个根瘤切开后，再用镊子夹住根瘤在固体YMA（含刚果红终浓度25 ppm）培养基上划线，在28℃恒温培养箱中倒置培养5～7d直至有清晰的菌落长出，并且根据菌体的形态、大小、透明度、黏稠度、颜色、光泽等特征，对分离得到的根瘤菌单克隆进行3～4次的划线纯化，直到长出清晰的单克隆，挑取单菌落转接冻干管，4℃低温保存，并将获得的菌株命名为奇台根瘤菌TRM95796和木垒根瘤菌TRM96647。
[0018]实施例二、奇台根瘤菌TRM95796和木垒根瘤菌TRM96647的鉴定为进一步确定根瘤菌TRM95796和TRM96647的分类学地位，本专利技术采用多相分类方法对该菌株进行了分类鉴定。
[0019]形态观察用培养基LB培养基：胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，酵母提取物5g/L，调节pH为7.0
‑
7.2，30℃培养3天。
[0020]引物采用细菌通用引物由北京擎科生物科技有限公司上海分公司合成。其序列分别为：27F（5
’‑
AGAGTTTGATCCTGGCTC
‑3’
）和1492R（5
’‑
CGGCTACCTTGTTACGACTT
‑3’
）。
[0021]试验方法根瘤菌TRM95796和TRM96647形态学观察方法扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察：挑取根瘤菌TRM95796和TRM96647单菌落于LB液体培养基，30℃培养，离心收集菌体，加入2.5%戊二醛进行固定。用扫描和透射电子显微镜观察记录菌株形态，菌体形状和大小，有无鞭毛等。
[0022]根瘤菌TRM95796和TRM96647基因组DNA的提取方法收集培养平板上的TRM95796和TRM96647菌体放入1.5mL的无菌离心管中，加入480μL的1
×
TE缓冲液。加入20μL溶菌酶（50mg
·
m L
‑1），放入37℃摇床中，200rpm振荡过夜。每管加入50μL 20％的SDS，加入5μL 20mg
·
m L
‑1的蛋白酶K，放入60℃摇床中，200r/min振荡1h。加入550μL的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），12000rpm离心10min，取上清移入另一离心管中，反复抽提2
‑
3次。取上清，加入等体积的无水乙醇，加入0.1倍体积的乙酸钠 （3mol
·
L
‑1），放入4℃冰箱中沉淀DNA约0.5h。12000rpm离心10min，弃上清。用200μL的70％乙醇清洗离心产物2次，12000rpm离心5min，弃上清，将乙醇挥发完全。用50μL无菌超纯水充分溶解底部的DNA，1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，将提取的DNA放入
‑
20℃冰箱中保存备用。
[0023]根瘤菌菌TRM95796和TRM96647 16S r RNA基因的扩增方法用细菌16S r RNA基因通用引物27F（5
’‑
AGAGTTTGATCCTGGCTC
‑3’
）和1492R（5
’‑
CGGCTACCTTGTTACGACTT
‑3’
）扩增细菌基因组DNA中的16S r RNA基因片段。
[0024]25μL的PCR反应体系为：dd H2O 20.4μL，10
×
Buffer（缓冲液含Mg
2+
）2.5μL，dNTPs 0.5μL，引物27F（10μmol
·
L
‑1）0.5μL，引物1492R（10μmol
·
L
‑1）0.5μL，Taq DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种能够促进鹰嘴豆结瘤固氮的根瘤菌，其特征在于，其为木垒根瘤菌（Rhizobium muleiense），保藏号为GDMCC No.62640。2.如权利要求1所述的根瘤菌的培养方法，其特征在于，其培养所用的培养基为YMA培养基：甘露醇10g/L，酵母浸粉0.4g/L，K2HPO
4 0.5g/L，MgSO
4 0.2g/L，微量元素4mL；所述微量元素营养液包括0.22g ZnSO4，1.81g MnSO4，2 .86g H3BO3，0 .8g ，CuSO4·
5H2O和0 .02g H2MoO4，琼脂18g/L，水1L，调节pH为7.0
‑
7.2。3.如权利要求2所述的根瘤菌的培养方法，其特征在于，发酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：万传星，沈红玲，梁红丽，谷荣，
申请(专利权)人：塔里木大学，
类型：发明
国别省市：