一种HEL-S-283基因敲除人结肠癌HCT116细胞株的构建方法技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体公开了一种HEL

【技术实现步骤摘要】
一种HEL
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S
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283基因敲除人结肠癌HCT116细胞株的构建方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其是涉及一种敲除HEL
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S
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283基因的人结肠癌HCT116细胞株的构建方法。

技术介绍

[0002]结肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤。据统计，2020年结肠癌的全球发病率高达10.0％，仅次于肺癌和乳腺癌，且其在癌症中的致死率位居所有恶性肿瘤第二位(9.4％)，仅次于肺癌。随着社会老龄化的进展、人们饮食结构与生活方式的改变,结肠癌的发病率不断增高。约60％患者在初诊时已处于病程的中晚期,失去了根治性手术治疗的机会。而早期患者根治术后一旦发生复发转移,也将会严重威胁患者的生存。深入探索结肠癌的发生转移机制，探索新型复发转移相关标志物已成为近年来的研究热点，对其深入探索将有助于优化结肠癌患者个体化精准治疗。因此，寻找特异性高、灵敏度好、稳定性强的肠癌早期诊断标志物，明确其在肿瘤发生、转移过程中的重要作用，有利于指导临床
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患者的治疗方式，提高恶性肿瘤患者术后生存率及改善患者生活质量。
[0003]HEL
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S
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283也被称为REGγ、PA28γ或11Sγ，是11S蛋白酶体激活因子家族的一员。HEL
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S
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283可通过激活20S蛋白酶体以非泛素和非ATP依赖的方式降解多个靶蛋白，发挥调节细胞周期、转录、信号传导、死亡和免疫反应的能力。有研究者利用免疫组化法检测了包含肺癌、甲状腺癌、结肠癌和肝癌及相应癌旁组织的组织芯片中HEL
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S
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283的表达水平，发现HEL
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283在这几种肿瘤组织中明显的高表达(病例数超过了50％)，进一步分析发现，HEL
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S
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283作用于各个信号通路参与多种肿瘤的发生发展。因此，HEL
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S
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283已成为肿瘤基础研究领域的热点之一。
[0004]CRISPR
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Cas9系统是从细菌和古生菌对抗外来病毒或质粒的适应性免疫系统发展而来，包括三种不同的类型，其中TypeⅡ型的CRISPR/Cas系统的DNA内切酶Cas9只有一个亚基，结构最为简单，所以应用也最广泛。除了Cas9蛋白外，该系统还包括两条短的CRISPRRNAs(crRNAs)和trans
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activating crRNAs(tracrRNA)。由于CRISPR
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Cas9系统具有操作简单，切割效率高等特点，被认为有更好的应用前景。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服上述现有技术存在的缺点与不足，提供一种HEL
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S
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283基因敲除人结肠癌HCT116细胞株及其构建方法。本专利技术所述HEL
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S
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283基因敲除人结肠癌HCT116细胞株为临床上结肠癌的防治，发病机制的研究和抗结肠癌药物的筛选提供了重要意义。
[0006]本专利技术提供了一种HEL
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S
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283基因敲除人结肠癌HCT116细胞株的构建方法，包括以下步骤：
[0007](1)针对人结肠癌HCT116细胞HEL
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S
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283基因的编码序列，设计得到sgRNAs序列，所述sgRNAs包含sgRNA1和sgRNA2；
[0008](2)将步骤(1)得到的sgRNAs克隆到CRISPR
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V2载体上，获得CRISPR
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V2
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HEL
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S
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283
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gRNA1和CRISPR
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V2
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HEL
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S
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283
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gRNA2质粒；
[0009](3)使用脂质体转染法，将所述步骤(2)得到的CRISPR
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V2
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HEL
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S
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283
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gRNA1和CRISPR
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V2
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HEL
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S
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283
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gRNA2质粒转染人结肠癌HCT116细胞；
[0010](4)将转染后的HCT116细胞常规培养36
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48小时；
[0011](5)第一次筛选：对步骤(4)中培养的细胞进行有限稀释法获得单克隆细胞，培养得到单克隆细胞株；
[0012](6)第二次筛选：对步骤(5)中单克隆细胞株有限稀释法获得单克隆细胞，继续培养得到HCT116HEL
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S
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283
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单克隆细胞株；
[0013](7)提取HCT116HEL
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S
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283
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单克隆细胞株基因组DNA，PCR扩增sgRNA序列，分析扩增产物；无法扩增出理论长度片段的细胞株，即为HCT116HEL
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S
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283
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细胞株。
[0014]步骤(1)中，所述sgRNAs序列为：
[0015]sgRNA1：TCATGGTAGGATTGTGACAAAGG(SEQ ID NO.1)
[0016]sgRNA2：AACCATGAAGTCATCTAGCAGGG(SEQ ID NO.2)
[0017]步骤(3)中，所述转染中用到的转染试剂为Lipofectamine
TM
3000(Thermo Scientific
TM
，Cat No.：L3000150)。
[0018]步骤(5)、(6)中所述的有限稀释法中的铺板细胞密度优选为0.3～0.5个细胞/孔。
[0019]步骤(5)中，所述的培养的时间为7～14天；优选地，为12～14天。
[0020]步骤(6)中，所述的培养时间为7天。
[0021]步骤(7)中，PCR扩增引物序列为：
[0022]Primers for Region 1(退火温度62.0℃):
[0023]上游引物:GGGTATCTTGTGATGGAGATGTGG(SEQ ID NO.3)
[0024]下游引物:GCACTTCAGGTGGGGTACTT(SEQ ID NO.4)
[0025]Primers for Region 2(退火温度62.0℃):
[0026]上游引物:T本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种HEL
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S
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283基因敲除人结肠癌HCT116细胞株的构建备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)针对人结肠癌HCT116细胞HEL
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S
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283基因的编码序列，设计得到sgRNAs序列，包含sgRNA1和sgRNA2；(2)将步骤(1)得到的sgRNAs克隆到CRISPR
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V2载体上，获得CRISPR
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V2
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HEL
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S
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283
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gRNA1和CRISPR
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V2
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HEL
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S
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283
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gRNA2质粒；(3)使用脂质体转染法，将所述步骤(2)中的CRISPR
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V2
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HEL
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S
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283
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gRNA1和CRISPR
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V2
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HEL
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S
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283
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gRNA2质粒共转入人结肠癌HCT116细胞株；(4)将转染后的HCT116细胞株常规培养36
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48小时；(5)第一次筛选：对步骤(4)中培养后的细胞有限稀释法获得单克隆细胞，培养得到单克隆细胞株；(6)第二次筛选：对步骤(5)中获得的单克隆细胞株有限稀释法获得单克隆细胞，继续培养得到HCT116 HEL
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S
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283
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单克隆细胞株；(7)提取HCT116 HEL
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283
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单克隆细胞株基因组DNA，PCR扩增sgRNA序列，分析扩增产物；无法扩增出理论长度片段的细胞株，即为HCT116 HEL
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S
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283
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细胞株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述sgRNAs的靶序列分别为：TCATGGTAGGATTGTGACAAAGG和AACCATGAAGTCATCTAGCAGGG。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述转染中用到的转染试剂为L...

【专利技术属性】
技术研发人员：李磊，陈慧，沈诗慧，施培林，关秋景，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：