治疗线粒体障碍的方法技术

本文提供了通过将核酸分子离体导入造血干细胞和祖细胞(HSPC)，然后将HSPC移植入需要治疗的受试者中来治疗与线粒体功能紊乱相关的疾病或障碍的方法。所述核酸分子可以包括功能性人共济蛋白(hFXN)或者可以包括在转染到细胞中时除去内源性hFXN的三核苷酸延伸突变的基因编辑系统。的基因编辑系统。的基因编辑系统。

【技术实现步骤摘要】
个GAA重复序列，而FRDA患者中的扩展的等位基因可由90至1700个重复序列组成(SEQID NO：12)(参见图1B)。GAA重复序列扩展导致共济蛋白的表达降低，共济蛋白是一种 高度保守的线粒体蛋白，主要在富含线粒体的组织(包括神经系统、肌肉和心脏)中表达。 此外，与正常表达相比，载体(扩展的等位基因的杂合子)示出共济蛋白mRNA和蛋白质 水平降低约50％，但它们未示出任何症状。虽然共济蛋白的功能尚未完全阐明，但它是参与 Fe
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S簇装配的铁结合蛋白，而且，在不存在共济蛋白时，铁在线粒体内积累，导致有缺陷的 铁介导的生物合成过程和增加的氧化应激。
[0013]在从大肠杆菌分离的超螺旋质粒中，扩展的GAA重复序列形成分子内三股螺旋体(三 链体)，即所谓的H
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DNA。提出了示出在扩展的GAA重复序列处形成的三链体结构的几种 模型，并且最近提供了在体外病理性GAA扩展序列中嘧啶基序H
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DNA结构的直接证据。 此外，利用凝胶电泳和原子力显微镜在含有共济蛋白GAA重复序列的质粒中观察到形成称 为“粘性DNA(sticky DNA)”的更高级结构。尚未解析出粘性DNA的分子结构；然而， 目前的证据表明粘性DNA形成为一个长的分子内三链体结构或者由两个三链体缔合而成。
[0014]所观察到的对DNA复制和转录的影响取决于质粒中GAA重复序列的长度和取向，这 与特定DNA结构(H
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DNA)的形成有关。最后，GAA重复序列与相邻区域中的DNA甲基 化和组蛋白乙酰化模式以及沉默染色质的形成有关。认为GAA重复序列中H
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DNA及更高 级结构的存在招募染色质重构蛋白复合物，使得保持紧密的染色质结构，导致共济蛋白基因 转录下调。
[0015]大量数据已经证明，对GAA重复序列的分析构成了FRDA诊断以及临床诊断的重要部 分。还进行了分子遗传测试以鉴定载体和产前测试。目前的FA诊断方法涉及聚合酶链式反 应(PCR)分析和Southern印迹技术。通过扩增共济蛋白基因中含有GAA重复序列的DNA 区域进行PCR测试。用于对GAA重复扩展序列作图的不同PCR反应是经典PCR、长程PCR 或三重引物PCR(TP
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PCR)。在所有情况下，采用琼脂糖凝胶电泳和DNA测序分析PCR片 段的大小。在大多数情况下，将PCR和Southern印迹两者组合以补充结果。在利用PCR扩 增中等尺寸和长尺寸GAA重复序列(即，重复序列数目>200)期间遇到的问题已有报道。 扩展序列的重复性质及其采用H
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DNA和更高级DNA结构的能力是导致聚合酶停止从而导 致错误结果的两个主要因素。
[0016]迄今为止，针对这样的线粒体疾病尚没有已知的治疗方法或预防措施，目前的疗法涉及 治疗相关症状。因此，本领域需要用于治疗线粒体疾病/障碍的替代或改进方法。

技术实现思路

[0017]因此，在一个方面，本专利技术提供了一种治疗受试者的线粒体疾病或障碍的方法。该方法 包括将功能性人共济蛋白(hFXN)离体导入受试者的造血干细胞和祖细胞(HSPC)，并将 HSPC移植入受试者，从而治疗线粒体疾病或障碍。导入步骤可包括使包含编码hFXN的多 核苷酸和FXN启动子(或可与多核苷酸一起操作并且在细胞中的其他调节序列)的载体与 HSPC接触并使得hFXN表达。在各种实施方案中，线粒体疾病或障碍选自以下项组成的组： 弗里德赖希氏共济失调(FRDA)、糖尿病、Leigh综合征、Leber遗传性视神经病变、肌神 经性胃肠性脑病和癌症。受试者可以是哺乳动物，例如人。在各种实施方案中，载体是自失 活(SIN)
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慢病毒载体，例如pCCL
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FRDAp
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FXN。在各种实施方案中，hFXN的表达在移植 后约6至
12个月内修正神经、心脏和肌肉并发症。在另一个方面，将hFXN多核苷酸在体 内导入受试者的HSPC中。
[0018]另一方面，本专利技术提供了一种治疗受试者的线粒体疾病或障碍的方法，该方法包括使来 自受试者的表达hFXN的细胞与编码基因编辑系统的载体接触，所述基因编辑系统在转染入 细胞时除去内源性hFXN的三核苷酸延伸突变，从而治疗线粒体疾病或障碍。在各种实施方 案中，基因编辑系统选自由CRISPR/Cas、锌指核酸酶和转录激活因子样效应因子核酸酶组 成的组。接触步骤可包括从受试者获得细胞样品，将基因编辑系统转染或转导到细胞样品中 以产生基因经修正的细胞，然后将基因经修正的细胞移植到受试者体内。细胞样品可以是表 达hFXN的任何细胞，例如来自受试者的血细胞和HSPC。
[0019]另一方面，本专利技术提供了一种表达盒，该表达盒包含与编码hFXN的多核苷酸功能性连 接的启动子或调节序列。还提供了载体，例如自失活(SIN)
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慢病毒载体，该载体包括调节 序列(例如与编码hFXN的多核苷酸功能性连接的启动子)。
附图说明
[0020]图1A
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1D是示出WT HSPC的全身移植防止YG8R小鼠中的感觉神经元变性和神经行为 缺陷的图解和图示。图1A示出5月龄和9月龄的WT(n＝16)、YG8R对照(n＝4)、 YG8R/YG8R HSPC(n＝5)和YG8R/WT HSPC(n＝13)小鼠的结果。采用开场测试自主 活动，采用旋转杆测试协调性，采用自动步态分析系统测试步态并采用前肢握力测试肌肉力 量。数据表示为平均值
±
sem；*P<0.05，**P<0.005，***P<0.0005；NS统计学上无显著 性。对于三个实验组的统计学比较，使用方差(ANOVA)与作为受试者内变量测试的年龄 的混合分析，然后进行独立样本t检验。图1B是示出未受影响的(上图)共济蛋白基因(FXN) 的内含子1和FRDA(下图)FXN的内含子1的示图，并且按照出现的顺序分别公开了SEQID NO：15
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16。图1C示出来自代表性的9月龄WT(n＝15)、YG8R对照(n＝4)、YG8R/YG8R HSPC(n＝4)和YG8R/WT HSPC(n＝11)小鼠的腰椎DRG(L5)的Nissl染色切片。YG8R 对照的DRG显示出大的空泡(箭头)。比例尺：100μm。右图描绘了每个DRG区的总空泡 面积；数据表示为平均值
±
sem；**P<0.005；***P<0.0005。NS，统计学上无显著性。图 1D示出来自移植有WT GFP
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HSPC的YG8R小鼠的移植后7个月用抗GFP和抗NeuN染色 的代表性共聚焦图像。左图：腰椎(L5)DRG的图像显示出源自GFP
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HSPC的细胞的植入 遍及DRG。比例尺：100μm。放大图像(下图)显示出源自HSPC的细胞与DRG神经元的 频繁紧密关联。比例尺：20μm。右图：颈椎、胸椎和腰椎脊髓图像本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.受试者的造血干细胞和祖细胞(HSPC)在制备用于通过将功能性人共济蛋白(hFXN)的蛋白质或mRNA或两者的囊泡从所述HSPC或由所述HSPC分化的细胞递送至所述受试者中缺乏hFXN的细胞来治疗所述受试者的弗里德赖希氏共济失调(FRDA)的药物中的用途，其中，HSPC已导入与疾病或障碍有关的功能性hFXN基因或者在HSPC中与疾病或障碍有关的功能性hFXN基因已被修正；其中，所述HSPC将被移植到所述受试者；以及其中所述HSPC分化的细胞为巨噬细胞或小胶质细胞。2.根据权利要求1所述的用途，其中通过使包含编码所述功能性hFXN基因及与其功能性连接的调节序列的多核苷酸的载体与所述HSPC接触或者通过使用基因编辑方法并使基因产物表达，将所述功能性hFXN基因导入所述HSPC或者在所述HSPC中修正所述功能性hFXN基因。3.根据权利要求1所述的用途，其中所述受试者是哺乳动物。4.根据权利要求3所述的用途，其中所述受试者是人。5.根据权利要求2所述的用途，其中载体是选自由慢病毒、1型单纯疱疹病毒(HSV
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1)、腺病毒和AAV载体组成的组的病毒载体。6.根据权利要求2所述的用途，其中所述基因编辑方法是CRISPR/Cas9。7.根据权利要求1所述的用途，其中在所述HSPC移植到所述受试者后约6至12个月内，所述移植修正神经、心脏和肌肉并发症。8.根据权利要求1所述的用途，其中离体地将所述功能性hFXN基因导入所述HSPC或者离体地在所述HSPC中修正所述所述功能性hFXN基因。9.根据权利要求2所述的用途，其中所述载体是pCCL
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FRDAp
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FXN或pCCL
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EFS
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FXN。10.根据权利要求1所述的用途，其中将功能性hFXN的蛋白质或mRNA或两者的囊泡递送包括：将含有功能性hFXN的蛋白质或mRNA或两者的线粒体、含有功能性hFXN的蛋白质或mRNA或两者的囊泡、含有功能性hFXN的蛋白质或mRNA或两者的外泌体中的任意一项或多项从所述HSPC或由所述HSPC分化的细胞转移至缺乏hFXN的细胞。11.根据权利要求1所述的用途，其中将功能性hFXN的蛋白质...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯蒂芬妮，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：