一种靶向SARS-CoV-2-S1-RBD的鲨鱼单域抗体及其应用和试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种靶向SARS

【技术实现步骤摘要】
一种靶向SARS
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CoV
‑2‑
S1
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RBD的鲨鱼单域抗体及其应用和试剂盒


[0001]本专利技术涉及抗体领域，具体涉及一种靶向SARS
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CoV
‑2‑
S1
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RBD的鲨鱼单域抗体及其应用和试剂盒。

技术介绍

[0002]COVID
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19通过吸入或与感染的飞沫接触传播，潜伏期为2至14天甚至更长，其常见的临床特征包括发热、咳嗽、疲劳、肌痛、呼吸困难等。感染后可能迅速发展为急性呼吸窘迫综合征或多器官功能障碍等，甚至会导致死亡。SARS
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CoV
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2是一种有包膜的单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科。SARS
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CoV
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2基因组大小约29.8kb，含有14个ORFs，可编码27个蛋白，其中包括4种较为保守结构蛋白：刺突蛋白S、包膜蛋白E、膜糖蛋白M和核衣壳蛋白N，以及8种辅助蛋白3a，3b，p6，7a，7b，8b，9b和orf14等。
[0003]SARS
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CoV
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2进入宿主细胞是由刺突糖蛋白S(spike glycoprotein，S蛋白)介导的。S蛋白全长约1273～1285个氨基酸，包含S1和S2两个亚基，其中N端的S1亚基为受体结合区，胞外结构域包含一个保守的受体结合域(receptor
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binding domain,RBD)，其介导病毒与宿主细胞表面血管紧张素转换酶2(ACE2)受体结合；C端的S2
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胞内结构域可以铆钉蛋白，作为膜融合亚单位，负责融合宿主细胞和病毒膜，使病毒基因组能够进入宿主细胞进行复制而引发疾病。相对比SARS
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CoV，SARS
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CoV
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2的S蛋白基因编码更长的刺突糖蛋白，其中包含了2个重要的突变：一是与大部分β冠状病毒不同，SARS
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CoV
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2S蛋白的2个亚基交界处存在多碱基切割位点，使其在侵入细胞的同时增加细胞间的融合。二是RBD区域6个主要氨基酸中有5个发生突变，这使得RBD与ACE2结合时具有更高的亲和力。ACE2是一种跨膜糖蛋白，主要分布在器官组织的内皮细胞和平滑肌细胞上，在人的口鼻黏膜，心肌细胞，肺，小肠，肾，胆管，膀胱上皮细胞以及食道回肠等多个组织和器官中均有高表达，在部分免疫细胞如巨噬细胞，树突状细胞，单核细胞也表达。因此，作为SARS
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CoV
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2的受体，SARS
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CoV
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2与ACE2结合后侵入人体，会引起心肌损伤，呼吸系统，消化系统，循环泌尿系统和免疫系统等多种疾病。因此，S蛋白的差异性，与ACE2结合大的特异性决定了其作为药物靶点的重要性，阻断S蛋白与ACE2结合，就能直接阻断SARS
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CoV
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2进入宿主细胞，从而阻止病毒感染人体引发的一系列疾病的产生。
[0004]鲨鱼新抗原受体(Immunoglobulin new antigen receptor，IgNAR)是一类新型天然抗体，可广泛的与抗原进行识别和结合。IgNAR在结构上是由两条重链构成的同型二聚体，每条链均含有1个可变结构域和5个恒定域，与经典的抗体分子结构相比，发挥抗原结合的可变结构域缺少CDR2区域，而相应的发挥关键识别结合作用的CDR3区较长，能够更好地识别一些隐藏的抗原表位，具有抗原高结合能力。随后，研究者又从鲨鱼新抗原受体可变区片段(variable NAR,VNAR)基因库中获得了只含有重链可变区的抗原结合域的单域抗体(single
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domain antibodies,sdAbs)。由于其具有独特的结构，基于重链抗体结构而设计改造的抗体类药物的研发取得了重大进展。因此，筛选获得具有良好活性的鲨鱼抗体具有
潜在的价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种靶向SARS
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CoV
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S1
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RBD的鲨鱼单域抗体及其应用和试剂盒。所述鲨鱼单域抗体包括一种单价鲨鱼单域抗体和四种双价鲨鱼单域抗体。
[0006]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种靶向SARS
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CoV
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S1
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RBD的单价鲨鱼单域抗体，其编码核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0008]进一步的，所述单价鲨鱼单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0009]进一步的，所述单价鲨鱼单域抗体中包含抗原决定簇互补区CDR和骨架区FR。
[0010]进一步的，所述抗原决定簇互补区CDR包含氨基酸序列为DSSCALDSC的DR1和氨基酸序列为RAYAGMDCRWDG的CDR3。
[0011]进一步的，所述骨架区FR包含氨基酸序列为VEQTPTTTTKEAGESLTINCVLR的FR1；氨基酸序列为：SAWYFTKKGATKKE的FR2；氨基酸序列为SLSNGGRYAETVNKASKSFSLRISDLRVEDSGTYHC的FR3。
[0012]进一步的，所述鲨鱼单域抗体的制备步骤为：
[0013](1)利用重组的SARS
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CoV
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S1
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RBD抗原蛋白对斑竹鲨鱼进行免疫；
[0014](2)采集免疫后的鲨鱼外周血，分离淋巴细胞；
[0015](3)提取鲨鱼外周血总RNA，反转录得到cDNA；使用引物BamVF1和BamVR1进行扩增，得到鲨鱼单域抗体文库片段；
[0016](4)将鲨鱼单域抗体文库片段经酶切，连接，插入pHEN
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2噬菌粒载体中，并转化至大肠杆菌TG1中，构建噬菌体展示抗体免疫文库；从文库中随机挑取10个克隆，进行序列测定和分析，使文库中大于99％的克隆包含目的插入序列；
[0017](5)用3轮淘选的方法筛选抗体免疫库中的鲨鱼单域抗体；
[0018](6)多克隆噬菌体
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ELISA方法验证筛选的鲨鱼单域抗体与SARS
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RBD抗原结合；
[0019](7)单克隆噬菌体
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ELISA方法验证筛选的鲨鱼单域抗体与SARS
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CoV
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S1
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RBD抗原结合；
[0020](8)对含有表达鲨鱼单域抗体噬菌体的单克隆进行测序，得到鲨鱼单域抗体的氨基酸序列。
[0021]本专利技术还提供了一种靶向SARS
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CoV
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向SARS
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CoV
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S1
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RBD的单价鲨鱼单域抗体，其特征在于：所述单价鲨鱼单域抗体的编码核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.根据权利要求1所述的单价鲨鱼单域抗体，其特征在于：所述单价鲨鱼单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。3.根据权利要求2所述的单价鲨鱼单域抗体，其特征在于：所述单价鲨鱼单域抗体中包含抗原决定簇互补区CDR和骨架区FR。4.根据权利要求3所述的单价鲨鱼单域抗体，其特征在于：所述抗原决定簇互补区CDR包含氨基酸序列为DSSCALDSC的CDR1和氨基酸序列为RAYAGMDCRWDG的CDR3。5.根据权利要求3所述的单价鲨鱼单域抗体，其特征在于：所述骨架区FR包含氨基酸序列为VEQTPTTTTKEAGESLTINCVLR的FR1；氨基酸序列为：SAWYFTKKGATKKE的FR2；氨基酸序列为SLSNGGRYAETVNKASKSFSLRISDLRVEDSGTYHC的FR3。6.一种靶向SARS
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【专利技术属性】
技术研发人员：顾玉超，柳晓春，肖国凯，徐锡明，于文功，席晓志，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：