一种表达沉默PD-L1基因的E1A/E1B双突变溶瘤腺病毒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种表达沉默PD

【技术实现步骤摘要】
一种表达沉默PD
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L1基因的E1A/E1B双突变溶瘤腺病毒及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种表达沉默PD
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L1基因的E1A/E1B双突变溶瘤腺病毒及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]癌症的发病率逐年上升，早期癌有治愈可能，然而中晚期癌即使采用手术，放化疗，分子靶向药物及免疫治疗仍然无法治愈，需要开发新的治疗方法。
[0003]溶瘤腺病毒可以选择性地在肿瘤细胞内复制并破坏肿瘤而正常细胞不受影响，被认为是一种新型的抗肿瘤药物。其具有肿瘤选择性复制的理论基础是：腺病毒的复制需要细胞周期进入S期，腺病毒感染细胞后，其早期蛋白E1A与宿主细胞的 RB蛋白结合，激活E2F转录因子，迫使细胞周期进入S期，从而为腺病毒的复制提供了良好的环境。但是随着E2F的激活，p53也被激活。P53蛋白使细胞周期阻止在G1期或诱导细胞凋亡，从而限制了病毒的复制。然而腺病毒的E1B55KD蛋白可以结合并使p53蛋白失活，最终使细胞周期进入S期，从而使腺病毒能够在宿主细胞内复制。因此，E1B55KD缺失的腺病毒不能结合并失活p53蛋白，因而在p53 功能正常的细胞如正常细胞内不能复制，然而在p53功能异常的细胞，如肿瘤细胞内可以复制。溶瘤腺病毒感染癌细胞并在其内大量复制，致使癌细胞溶解并释放出大量病毒，释放出的病毒可再次感染临近组织细胞，如此反复循环，每一次循环病毒滴度都会成千上万倍地增加，直至肿瘤完全被破坏，被认为是治疗肿瘤有前途的手段。
[0004]Bischoff等1996年首先报道了E1B55KD缺失的溶瘤腺病毒dl1520(又叫做 ONYX
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015)能选择性地在p53基因突变的肿瘤细胞内复制并破坏肿瘤细胞，而在正常细胞内不能复制。但ONYX
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015临床试验用于头颈部癌的治疗没有临床获益而终止。我国学者构建了与ONYX
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015相似的溶瘤腺病毒安柯瑞(H101:E1B 55KD缺失)用于治疗头颈部鳞癌显示了满意的客观反应率,安柯瑞于2005年被我国食品药品监督管理局获批上市,这是世界上第一个上市的溶瘤病毒。自2000年，国际上报道了以Rb传导途径异常的肿瘤为靶向变的溶瘤腺病毒dl922
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947、Delta
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24(E1A与Rb 结合位点的突变消除了病毒与细胞Rb的结合)和CG0070(嵌入了E2F启动子可以靶向Rb异常的肿瘤)。CG0070膀胱内灌注治疗非肌层浸润性膀胱癌的二期临床试验显示了满意的疗效,目前正在进行三期临床试验。Delta
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24
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RGD(腺病毒链接RGD结构, 可以增强感染效率)治疗脑胶质瘤的一、二期临床试验正在进行。尽管E1A或E1B 单一突变的溶瘤腺病毒已经进入临床试验阶段，但有研究表明：E1A或E1B单一突变的腺病毒在正常细胞内仍有一定程度的复制，导致对正常细胞的毒性。另外，免疫检查点抑制剂广泛用于恶性肿瘤的治疗，但单独使用其客观反应率不足30％，大多数有反应的患者在使用免疫检查点抑制剂后，即使初期很有效，但没有表现出持久的缓解。现有的基于抗体的药物通过构象阻断细胞表面上的PD
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L1起作用，但是最近的研究表明PD
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L1并非全部存在于细胞表面，也存在于细胞内，并且可以通过循环重新填充到细胞膜上。

技术实现思路

[0005]本专利技术为了解决上述技术问题，提供了一种表达沉默PD
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L1基因的E1A/E1B 双突变溶瘤腺病毒及其制备方法和应用。
[0006]本申请是采用以下技术方案得以实现的。
[0007]一种表达沉默PD
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L1基因的E1A/E1B双突变溶瘤腺病毒，所述腺病毒E1A与 RB结合位点两个氨基酸替换突变、E1B55KD缺失、纤毛部分链接RGD、E1A启动子插入CD274的shRNA。
[0008]本申请构建的溶瘤腺病毒Ad
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E1M
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RGD
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shPDL1既具有E1A与Rb结合位点的突变，同时有E1B55KD的缺失，消除了病毒与正常细胞Rb和p53蛋白结合的能力，因此限制了其在正常细胞内的复制，从而提高了安全性。而且，E1A,E1B双突变病毒可以在p53传导途径和/或Rb传导途径异常的肿瘤内复制并破坏肿瘤，具有广泛的抗肿瘤谱。而溶瘤腺病毒Delta
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24删除了CR
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2区，消除了与宿主细胞Rb结合的能力,但其E1B55KD未做改造,因此可以结合并失活正常细胞的p53，不能阻止细胞进入S期，从而导致病毒在正常细胞内的复制并破坏正常细胞。而且Delta
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24只在 Rb传导途径异常的肿瘤细胞内复制，而在Rb传导途径无异常的肿瘤内不复制，限制了它的应用范围。溶瘤腺病毒ONYX
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015和安柯瑞删除了E1B55KD，不能结合并失活正常细胞的p53，功能性p53可以诱导细胞凋亡。但这两个病毒的E1A都是野生型的,可以结合正常细胞的Rb，释放E2F，促使细胞进入S期，从而为腺病毒的复制提供了良好的环境，病毒可以在正常细胞内复制。而且,这两个病毒都只在p53 传导途径异常的肿瘤内复制,而在p53传导途径正常的肿瘤内不复制,也限制了其应用范围。
[0009]病毒感染需要病毒与宿主细胞膜上的腺病毒受体(CAR)结合才能进入细胞，然而，进展期或转移性癌缺乏CAR的表达，因此抵抗病毒的感染，从而降低溶瘤效果。但绝大多数肿瘤表达整合素(αvβ3或αvβ5)，其配体是RGD，因此，本申请构建的溶瘤腺病毒Ad
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E1M
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RGD
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shPDL1在病毒纤维部分链接了RGD肽链，该病毒不依赖CAR，而是直接与肿瘤表面的整合素结合，大大提高了感染效率。而Delta
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24、 ONYX
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015、安柯瑞都没有链接RGD，这些病毒对CAR阴性的癌细胞感染效率低下，大大影响感染效率及溶瘤效果。
[0010]肿瘤细胞高表达PD
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L1其恶性程度高，预后差，而降低PD
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L1的表达可降低癌细胞的恶性程度并有望改善患者的预后。另外，肿瘤免疫逃逸的重要原因之一是肿瘤细胞产生过的PD
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L1，因此降低PD
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L1的细胞丰度是PD
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L1作为关键免疫抑制分子可靠且持久靶向的关键。本申请构建的溶瘤腺病毒Ad
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E1M
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RGD
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shPDL1携带沉默PD
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L1的基因,可以降低肿瘤细胞PD
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L1的表达，有望增强机体的抗肿瘤免疫效果。而表达沉默PD
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L1基因的溶瘤腺病毒尚无报道。
[0011]溶瘤病毒感染并在肿瘤细胞内复制本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达沉默PD
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L1基因的E1A/E1B双突变溶瘤腺病毒，其特征在于：所述腺病毒的E1A与RB结合位点两个氨基酸替换突变、E1B55KD缺失、纤毛部分链接RGD、E1A启动子插入CD274的shRNA。2.一种权利要求1所述表达沉默PD
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L1基因的E1A/E1B双突变溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：S1.构建pXC3E1A/E1B
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shCD274质粒：a.构建靶向人CD274145
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165位的CD274短发夹RNA；b.进行E1A(L122S/C124G)突变，并删除E1B
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55KD；c.合成U6
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shCD274
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E1A启动子
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E1A(L122S/C124G)
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E1B...

【专利技术属性】
技术研发人员：王华，蔡志坚，徐一鹏，
申请(专利权)人：王华，
类型：发明
国别省市：