铜离子抗原及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种铜离子抗原及其制备方法与应用。该铜离子抗原，是螯合剂与载体蛋白的偶联物与铜离子形成的络合物。本发明专利技术的制备铜离子抗原的方法能够方便、快捷地获得铜离子抗原，且合成步骤简洁明了、合成成本低，效果好。用本发明专利技术方法制备的铜离子抗原进行免疫得到的抗体的特异性好、最低检测限值低。本发明专利技术的制备铜离子抗原的方法及由该方法获得的铜离子抗原在铜离子的快速免疫检测应用中将有广阔的前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及铜离子抗原及其制备方法与应用。
技术介绍
重金属是环境与农产品中的重要污染物质，可以通过食物链在动物及人的体内富集，对人类健康会带来严重的危害。铜是生命体生长所必须的微量元素之一，但是高浓度的铜会对生命体产生毒害作用。 目前，重金属铜的分析方法主要有原子吸收光谱法、电感耦合等离子体发射光/质谱法、X-射线荧光光谱法、电位溶出分析法以及近几年发展的生物传感器检测法等。但是用这几种方法检测铜离子需要昂贵的仪器设备，检测费用高，耗时，不能用于现场快速检测。与仪器分析法相比，免疫分析法具有快速、简便、实时、易于进行现场检测、样品前处理简单、灵敏度高、选择性强、适合于高通量分析等优点，而且还能大幅度降低检测成本。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种铜离子抗原。 本专利技术所提供的铜离子抗原，是螯合剂与载体蛋白的偶联物与铜离子形成的络合物。 所述铜离子抗原的结构式如下 所述螯合剂与载体蛋白的偶联物是按照包括如下步骤的方法制备的先将所述螯合剂重氮化，得到重氮化的螯合剂，再将所述重氮化的螯合剂与所述载体蛋白进行偶联，得到所述偶联物； 所述螯合剂与载体蛋白的偶联物与铜离子形成的络合物是按照包括如下步骤的方法制备的将所述铜离子的溶液与所述螯合剂与载体蛋白的偶联物混合，进行络合反应，得到螯合剂与载体蛋白的偶联物与铜离子形成的络合物。 所述重氮化的方法包括如下步骤将所述螯合剂溶于酸的水溶液中，再向其中加入亚硝酸盐，进行重氮化反应，得到所述重氮化的螯合剂；所述重氮化反应的条件包括温度为0-5℃、避光；所述温度优选为0℃或4℃； 所述偶联的方法包括如下步骤将所述重氮化的螯合剂与所述载体蛋白混合，进行偶联反应，得到所述偶联物；所述重氮化的螯合剂与所述载体蛋白的摩尔比为(5-15)∶1，优选为10∶1； 所述将所述螯合剂溶于酸的水溶液中，所述酸可为盐酸、硫酸、硝酸或硼酸。 所述重氮化反应的时间为15min；所述螯合剂、酸和亚硝酸盐的配比为4mg∶2×10-3mol∶1.2×10-4mol； 所述偶联反应中，温度为4-10℃，pH值为8.5-9.0，反应时间为4-24h；具体可为反应温度为4℃，pH值为8.5，反应时间为4h。 所述络合反应中，所述螯合剂与载体蛋白的偶联物与所述铜离子的摩尔比为1∶(10-50)，优选为1∶20； 所述络合反应中，反应温度为4-25℃，pH值为7.0-8.0，反应时间为12-24h；具体可为反应温度为25℃，pH值为7.5，反应时间为12h。 所述螯合剂为对氨基苄基乙二胺四乙酸； 所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白或卵清白蛋白。 所述载体蛋白与所述重氮化的对氨基苄基乙二胺四乙酸反应前，先将所述载体蛋白溶解于缓冲液中；所述缓冲液可为碳酸盐、磷酸盐、硼酸盐或HEPES缓冲液，pH为9.0-10.0，具体可为9.5。 本专利技术的另一个目的是提供一种制备铜离子抗原的方法。 本专利技术所提供的制备铜离子抗原的方法，包括如下步骤 (1)将螯合剂重氮化，得到重氮化的螯合剂； (2)将载体蛋白与所述重氮化的螯合剂混合，进行偶联反应，得到载体蛋白与重氮化的螯合剂的偶联物； (3)将铜离子的溶液与所述载体蛋白与重氮化的螯合剂的偶联物混合，进行络合反应，得到铜离子抗原。 所述重氮化的方法包括如下步骤将所述螯合剂溶于酸的水溶液中，再向其中加入亚硝酸盐，进行重氮化反应，得到所述重氮化的螯合剂；所述重氮化反应的条件为温度为0-5℃、避光；所述温度优选为0℃或4℃。 所述将所述螯合剂溶于酸的水溶液中，所述酸可为盐酸、硫酸、硝酸或硼酸。 所述重氮化反应的时间为15min；所述螯合剂、酸和亚硝酸盐的配比为4mg∶2×10-3mol∶1.2×10-4mol； 所述偶联反应中，所述重氮化的螯合剂与所述载体蛋白的摩尔比为(5-15)∶1，优选为10∶1。 所述偶联反应中，温度为4-10℃，pH值为8.5-9.0，反应时间为4-24h；具体可为反应温度为4℃，pH值为8.5，反应时间为4h。 所述络合反应中，所述螯合剂与载体蛋白的偶联物与所述铜离子的摩尔比为1∶(10-50)，优选为1∶20。 所述络合反应中，反应温度为4-25℃，pH值为7.0-8.0，反应时间为12-24h；具体可为反应温度为25℃，pH值为7.5，反应时间为12h。 所述螯合剂为对氨基苄基乙二胺四乙酸； 所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白或卵清白蛋白； 所述载体蛋白与所述重氮化的对氨基苄基乙二胺四乙酸反应前，先将所述载体蛋白溶解于缓冲液中；所述缓冲液可为碳酸盐、磷酸盐、硼酸盐或HEPES缓冲液，pH为9.0-10.0，具体可为9.5。 由上述任一所述铜离子抗原制备得到的抗体也属于本专利技术的保护范围。 上述任一所述铜离子抗原和/或所述抗体在检测样品中铜离子的应用也属于本专利技术的保护范围。 所述样品为水体、食品或土壤。 所述应用可为利用所述铜离子抗原和/或所述抗体制备成检测样品中铜离子的酶联免疫试剂盒、发光免疫试剂盒和免疫亲和色谱柱等。 本专利技术的制备铜离子抗原的方法能够方便、快捷地获得铜离子抗原，且合成步骤简洁明了、合成成本低，效果好。用本专利技术方法制备的铜离子抗原进行免疫得到的抗体的特异性好、最低检测限值低。本专利技术的制备铜离子抗原的方法及由该方法获得的铜离子抗原在铜离子的快速免疫检测应用中将有广阔的前景。 附图说明 图1为铜离子抗原的合成路线图。 图2为以EDTA-Cu为标准样品建立的铜离子间接ELISA法标准曲线。 具体实施例方式 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 对氨基苄基乙二胺四乙酸(Aminobenzyl-EDTA)购于Sigma公司，产品号A3473.，弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，EDTA，牛血清白蛋白，卵清白蛋白和CuCl2(原子吸收级)均购于Sigma公司，羊抗小鼠IgG-HRP购自Jackson公司，其余常规试剂均购自北京化学试剂公司。 实施例1、铜离子抗原及其制备 一、铜-对氨基苄基乙二胺四乙酸-卵清白蛋白(Cu-对氨基苄基-EDTA-OVA)抗原的制备 1、重氮化对氨基苄基乙二胺四乙酸(Aminobenzyl-EDTA)4mg，溶解于2mL 1M的HCl水溶液中，得到溶液I；在0℃避光条件下，向溶液I中滴加60ul 2M的NaNO2水溶液，搅拌反应15分钟，得到重氮化的对氨基苄基乙二胺四乙酸的酸性溶液。该反应体系中对氨基苄基乙二胺四乙酸、HCl和NaNO2的配比为4mg∶2×10-3mol∶1.2×10-4mol。 重氮化的对氨基苄基乙二胺四乙酸的结构式如式I所示。 2、偶联将步骤1得到的重氮化的对氨基苄基乙二胺四乙酸的酸性溶液在10分钟内加入到4mL含有45mgOVA的硼酸盐缓冲液(0.05M，PH9.6)中，调节pH值到8.5，4℃避光搅拌反应4小时，得到反应产物溶液，其中含有对氨基苄基乙二胺四乙酸与OVA的偶联物。该反应体系中所述重氮化的氨基苄基乙二胺四乙酸与所述载体蛋白OVA的摩尔比为10∶1。 对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种铜离子抗原，是螯合剂与载体蛋白的偶联物与铜离子形成的络合物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王保民，赵洪伟，南铁贵，谭桂玉，刘威，高巍，谭伟明，李召虎，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]