本发明专利技术公开了一种活体大量繁殖穿刺巴氏杆菌的方法。该方法是将附着穿刺巴氏杆菌的根结线虫接种于番茄上并进行培养。本发明专利技术的方法在筛选出活体扩繁根结线虫及穿刺巴氏杆菌的最佳寄主植物品种基础上，进一步对线虫接种量，接种时间、线虫接入次数及接入线虫后初期培养温度进行筛选，最终提高了单株番茄繁殖穿刺巴氏杆菌孢子的能力，穿刺巴氏杆菌的阳性侵染率可达４０％以上，单株总产孢量可达９．０×１０８以上。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种细菌活体繁殖的方法，具体地讲是涉及一种穿剌巴氏杆菌活体大量繁殖的方法。
技术介绍
穿剌巴氏杆菌(Pasteuria penetrans)寄生根结线虫(Meloidogyne spp.)，属于 革兰氏阳性菌。其繁殖方式是产生不具有游动性的休眠内生孢子。当根结线虫的二龄幼虫 在土壤中移动遇到孢子，通过接触，土壤中的休眠孢子附着于线虫的体表上，并随着二龄幼 虫侵入寄主植物的根系。当二龄幼虫在寄主植物中建立侵染点并开始取食之后，休眠孢子 萌发，产生侵染管并穿过线虫的体壁，侵入到线虫的假体腔，侵染后的线虫能继续取食，脱 皮，发育成三龄，四龄幼虫直至成虫。侵染后的雌虫不能产卵或只产生少量的卵，其假体腔 被穿剌巴氏杆菌充满，菌丝体大量繁殖，形状如花椰菜，菌丝体分化后进入产孢阶段，最终 每个雌虫体内能产生多达二百万个内生休眠孢子，这些休眠孢子随着根系和雌虫的分解进 入土壤中，完成其生活史。休眠孢子具有良好的抗逆性，能抗高温、干旱(燥)、高湿及各种 化学和物理因子。穿剌巴氏杆菌因其独特的抗逆性和作用机制，大量研究证明它是一种非 常有效防治根结线虫病的生防因子，具有广阔的开发前景。 然而，目前该菌难以在人工合成培养基上大量繁殖，成为大规模应用其防治线 虫的瓶颈，有学者将目光转移到了该菌活体培养方式的研究。早在1980年，Stirling 和Wachtel就提出了利用活体繁殖技术生产穿剌巴氏杆菌菌剂的技术(Stirling. G. R.. and Wachtel.M. F. 1980. Mass production of Bacillus penetrans for thebiological control of root-knot nematodes. Nematologica 26 :308-312)，随后Brown、 Channer、 Verdejo等学者相继对活体扩繁体系中孢子附着技术进行了研究，确立了几种穿刺巴 氏杆菌？包子附着的技术体系(Brown. S.M.， Smark. G. C. Jr. 1985. Root penetration by Meloidogyne incognitajuveniles infected withBacillus penetrans. Journal of Nematology 17 :123—126 ;Cha皿er. A. G. ， andS. R. Gowen. 1988. Preliminary studies on the potential of Pasteuri即enetrans to control Meliodogyne species. Proceedings of brighton cropprotection conference, pests and diseases. Surrey, England :The British CropProtection Council ;Verdejo.S. ， and B. A. Jaffee. 1988. Reproduction ofPasteuria penetrans in a tissue—culture system containing Meloidogynejavanica and Agrobacterium rhizogenes-transformed roots. Phytopathology 8 :1284-1286)。 此外，2006年Gomathi等人试验比较了四种不同植物活体繁殖穿剌巴氏杆菌的效率 (Gomathi. C.，咖ar. S. ， Subramanian. S. Effect of host planton mass product ion of Pasteuria penetrans. Indian Journal of Nematology. Nematological Society of India, New Delhi, India :2006. 36 :2,297-299)。 综述以上研究，国内外对活体扩繁中的接种体系并未展开系统的研究。本专利技术拟 通过对根结线虫的寄主品种、接种量、接种次数、接种时期进行筛选，优化穿剌巴氏杆菌活体繁殖体系，期望进一步提高穿剌巴氏杆菌活体繁殖的产量。
技术实现思路
本专利技术提供了一种活体大量繁殖穿剌巴氏杆菌繁殖的方法。 本专利技术所提供的穿剌巴氏杆菌活体繁殖的方法，是将附着穿剌巴氏杆菌的根结线 虫接种于番茄上并进行培养。 其中，所述番茄选自下述番茄品种中的任意一种白果强丰、佳粉18、秦星908、毛 粉802和嘉宝。上述番茄品种均可从当地蔬菜种子公司(如北京德胜种业发展有限公司) 购买获得。 所述根结线虫的接种量可为1000-12000条/株，优选为2000-10000条/株。具 体可为2000-5000条/株、5000-10000条/株。 所述接种中，对所述番茄进行接种的时期可为番茄的2-12片真叶期，优选为4-10 片真叶期。 所述接种中，附着穿剌巴氏杆菌的根结线虫对所述番茄进行接种的次数可为1-7 次，优选为2-5次。 将附着穿剌巴氏杆菌的根结线虫幼虫以最佳接种量在所述最佳番茄品种的最佳 接种时期接种后，可先放置在最适温度条件下培养一周后再转移至温室条件下进行培养。 所述最适温度条件为18°C _36"，优选为21°C _36°C ;所述温室条件为15°C _40°C 。 上述方法中，所述番茄品种可种植在最适宜穿剌巴氏杆菌繁殖的土壤中，所述土 壤具体可为砂壤土、中壤土或轻壤土，优选种植在中壤土中。 所述土壤可为不同土壤肥力的土壤，具体可分为施用基肥、不施用基肥、施用基肥 并追肥的土壤。 所述土壤也可为施用或不施用杀线剂的土壤，具体可分为未施用杀线剂土壤、施 用有机磷类杀线剂的土壤、施用氨基甲酸酯类杀线剂的土壤。 上述方法中，所述穿剌巴氏杆菌是通过离心将穿剌巴氏杆菌的孢子附着在线虫上 并侵染到线虫体内得到的。 上述方法中，所述附着穿剌巴氏杆菌的根结线虫是将根结线虫溶液和孢子溶液混 合，通过离心方法获得。 上述方法中，所述附着穿剌巴氏杆菌的根结线虫是将根结线虫溶液和剌巴氏杆菌 的孢子溶液混合后，离心得到的。 所述离心的条件为3000g-9000g离心2-7min，具体可为9000g离心3min。 本专利技术方法同样适用于穿剌巴氏杆菌(参考文献为SAYRE R M， STARR M P. Pasteuria penetrans (ex Thorne，1940)nom. rev. ， combn， sp.n. ， a mycelial andendospore-forming bacterium parasitic in plant-parasitic nematodes. Proceedings ofthe Helm in thological Society of Washington, 1985，52 :149-165) 种寄生其它根结线虫种的穿剌巴氏杆菌的大量繁殖，如寄生南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)、爪哇根结线本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种穿刺巴氏杆菌活体繁殖的方法，是将附着穿刺巴氏杆菌的根结线虫接种于番茄上并进行培养。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：简恒，何强，卜祥霞，陈忠孝，刘倩，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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