一种大米抗热肽剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及抗热肽剂技术领域，更具体地是涉及一种大米抗热肽剂及其制备方法和应用。以大米蛋白为培养基原料，以自主选育的地衣芽孢杆菌BTJQ4为培养菌株，通过地衣芽孢杆菌BTJQ4对含大米蛋白的培养基进行发酵，并通过木瓜蛋白酶进一步酶解制备抗热肽，并将其开发成为对益生菌具有热保护作用的抗热肽剂，提供了大米蛋白利用的新途径，极大地提高了稻谷加工副产物的附加值，具有很好的经济和社会效益。此外，在乳酸菌的生物活性多肽热保护方面填补了技术空白，为其他类似益生菌的喷雾干燥技术提供了生物活性肽热保护作用的新思路。了生物活性肽热保护作用的新思路。了生物活性肽热保护作用的新思路。

【技术实现步骤摘要】
一种大米抗热肽剂及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及抗热肽剂
，更具体地是涉及一种大米抗热肽剂及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]在菌剂产业化生产实践中，提高干制菌剂菌体的存活率，是长期以来保护剂选择、改良及优化的主要目的。喷雾干燥、流化床等热干燥方式是产业化、规模化批量制备工业微生物菌剂的常用手段。较高的干燥温度可以给发酵工业带来更有利的经济效益，并能大幅降低水电资源消耗、缩短生产周期、降低成本。干燥过程中，菌剂和热空气充分接触，高温和脱水导致菌体死亡，活菌量降低。因此，在热干燥过程中采用保护剂以提高菌体存活率具有重要意义。
[0003]菌剂在脱水过程中，热会造成菌体DNA、RNA、蛋白质(包括酶类)、细胞膜和核糖体等物质内在损伤，从而导致细胞失活。在热干燥过程中，抗热保护剂可通过不同途径在一定程度上减少菌体细胞的热损害。目前，常用的保护剂主要有以下几类：调节渗透压的添加剂主要为碱金属缓冲盐、糖类、多元醇、氨基酸等；乳化剂主要有司盘类、吐温类；抗氧化剂包括二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)和没食子酸内脂(PC)、维生素C、酚类等；还有一些大分子保护剂如阿拉伯胶、可溶性淀粉、脱脂乳、酪蛋白、乳清蛋白、β
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环糊精、微晶纤维素等。
[0004]乳酸菌是一种应用于发酵食品工业中的重要微生物,通过其代谢活动产生的乳酸及特殊风味物质可以赋予发酵食品特有的品质,被广泛应用于食品工业、生活保健与临床医学等领域中,因此乳酸菌发酵剂的制备与贮藏至关重要。冷冻干燥技术作为生产乳酸菌发酵剂的传统方法,具有成本高、耗时长及耗能多等缺点,而喷雾干燥具有低成本、高效快速、可连续生产等优点,是一种潜在的可替代冷冻干燥用于制备乳酸菌菌粉的干燥技术,但喷雾干燥过程中热空气对乳酸菌的致死效应导致干燥后乳酸菌的存活率较低。
[0005]近年来，生物活性肽因其来源广泛、易吸收利用、具有多种生理功能，成为蛋白领域新兴研究热点。生物活性肽不仅能促进生长，还可提高微生物低温、高渗透压等耐受性。中国专利申请CN112626157A公开了一种红曲糟抗热肽剂的制备方法，并将该红曲糟抗热肽剂用于酵母菌剂的抗热保护，效果显著。然而，目前肽类对乳酸菌等益生菌的热保护作用尚属研究空白。

技术实现思路

[0006]为此，需要提供一种大米抗热肽剂及其制备方法和应用，以弥补现有技术中生物活性肽类作为乳酸菌等益生菌的抗热保护剂技术的空白，并提供一种来源广泛、成本低廉、制备简单且生产高效的乳酸菌抗热肽剂制备方法，以期为乳酸菌等益生菌剂的规模化生产、储运提供有效的抗热保护。
[0007]为实现上述目的，本申请的第一方面，专利技术人提供了一种大米抗热肽剂的制备方
法，包括以下步骤：
[0008]活化菌种：将地衣芽孢杆菌BTJQ4接种于马铃薯葡萄糖肉汤培养基，所述地衣芽孢杆菌BTJQ4的保藏编号为CCTCC NO：M 2020892，接种于马铃薯葡萄糖肉汤培养基在45℃下以转速180rpm进行摇床培养18
‑
24h，得到活化后的菌种；
[0009]制备固体培养基：以质量份数计，将大米蛋白和麸皮以3:1混合均匀后进行高压灭菌，调整pH值为6
‑
7，得到固体培养基；
[0010]制备发酵培养基：以所述固体培养基的质量百分数计，将大米蛋白5
‑
7％，K2HPO40.3
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0.8％，NaH2PO40.3
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0.5％混合均匀，调整pH值为7
‑
8，进行高压灭菌，得到发酵培养基；
[0011]制备固体菌剂：将所述活化后的菌种接种于所述固体培养基，混合均匀后低速搅动培养，以pH值为6.5的磷酸缓冲液进行喷淋，保持所述固体培养基的湿度为45
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55％，于45℃下培养48h，得到第一固体菌剂，
[0012]制备大米抗热肽剂：将所述第一固体菌剂接种于所述发酵培养基，在45℃下以转速180rpm转动培养24h，升温至50℃，加入蛋白酶水解，灭酶后离心，收集上清液并冻干，得到所述大米抗热肽剂。
[0013]其中，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BTJQ4已于2020年12月11日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020892。经过专利技术人大量的对比试验发现，该地衣芽孢杆菌适合于大米蛋白培养基生长，产肽量高。
[0014]在本专利技术的一些实施方案中，所述制备固体培养基步骤中，调整pH值为6.5，保持所述含水率为45
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55％。这样设置，能够获得地衣芽孢杆菌BTJQ4最适的酸碱度和含水率发酵条件。
[0015]在本专利技术优选的实施方案中，所述摇床培养至生物量达108CFU/mL以上得到所述活化后的菌种。
[0016]在本专利技术优选的实施方案中，所述高压灭菌为在121℃高压灭菌20min。
[0017]在本专利技术其中一些实施方案中，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶，用量为50U/ml。如此，能够使地衣芽孢杆菌BTJQ4降解产生的抗热肽对乳酸菌的热激存活保护效果达到最佳。
[0018]在本专利技术优选的实施方案中，在所述灭酶后以10000r/min离心15min。
[0019]本申请的第二方面，专利技术人提供了一种大米抗热肽剂，采用本申请的第一方面提供的制备方法制备得到。
[0020]本申请的第三方面，专利技术人提供了一种大米抗热肽剂进行乳酸菌热保护的方法，其中，所述大米抗热肽剂为本申请的第二方面提供，包括以下步骤：
[0021]活化乳酸菌；
[0022]制备处于对数生长中期的乳酸菌，将所述活化乳酸菌以1％接种至20mL灭菌MRS肉汤培养基，接种后的起始OD600大约为0.1，置于30℃静置培养4h15min，达到对数生长中期，所述对数生长中期的MRS肉汤培养基OD600约为1；
[0023]制备乳酸菌悬液：将所述扩培后的乳酸菌于4℃离心10min收集菌体，水洗并再次离心，重复多次，以无菌水混匀后，得到乳酸菌悬液；
[0024]热激逆境：将所述乳酸菌悬液与所述大米抗热肽剂以体积比为1:9进行混合并置于50℃环境下热激20min。
[0025]本专利技术提供了将大米抗热肽剂用于乳酸菌的抗热保护的应用例子，但并不因此限制大米抗热肽剂在其他不同微生物菌剂抗热保护上的应用。
[0026]OD600是将波长设定为600nm时测定的光密度值,是追踪液体培养物中微生物密度的标准指标,通常用来指示菌体细胞密度。接种1％活化乳酸菌后起始OD600大约为0.1指的是：以不接种任何菌株的培养基为空白，以接种后的菌和培养基混合物为测试样品，测试结果减去空白的数值大约为0.1。同理，对数生长中期的MRS肉汤培养基OD600约为1指的是：以不接种任何菌株的培养基为空白，以对数生长中期的菌和培养基混合物为测试样品，将测试结果减去空白的数值大约为1。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大米抗热肽剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：活化菌种：将地衣芽孢杆菌BTJQ4接种于马铃薯葡萄糖肉汤培养基，所述地衣芽孢杆菌BTJQ4的保藏编号为CCTCCNO：M2020892，接种于马铃薯葡萄糖肉汤培养基在45℃下以转速180rpm进行摇床培养18
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24h，得到活化后的菌种；制备固体培养基：以质量份数计，将大米蛋白和麸皮以3:1混合均匀后进行高压灭菌，调整pH值为6
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7，得到固体培养基；制备发酵培养基：以所述固体培养基的质量百分数计，将大米蛋白5
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7％，K2HPO40.3
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0.8％，NaH2PO40.3
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0.5％混合均匀，调整pH值为7
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8，进行高压灭菌，得到发酵培养基；制备固体菌剂：将所述活化后的菌种接种于所述固体培养基，混合均匀后低速搅动培养，以pH值为6.5的磷酸缓冲液进行喷淋，保持所述固体培养基的湿度为45
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55％，于45℃下培养48h，得到第一固体菌剂，制备大米抗热肽剂：将所述第一固体菌剂接种于所述发酵培养基，在45℃下以转速180rpm转动培养24h，升温至50℃，加入蛋白酶水解，灭酶后离心，收集上清液并冻干，得到所述大米抗热肽剂。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备固体培养基步骤中...

【专利技术属性】
技术研发人员：林晓婕，梁璋成，何志刚，李维新，陈秉彦，苏昊，林晓姿，任香芸，
申请(专利权)人：福建省农业科学院农业工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：