一种人源肺癌TP53突变细胞模型的构建及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种人源肺癌TP53突变细胞模型的构建及其应用，具体涉及一种人源肺癌A549细胞TP53基因R273H位点突变的模型构建方法，包括所用gRNA序列、Oligo donor DNA序列以及检测突变位点的引物序列及检测方法，使用CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种人源肺癌TP53突变细胞模型的构建及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医学
，具体涉及一种人肺癌TP53突变细胞模型的构建、检测方法，以及该细胞株所能够进行的后续药物筛选的应用。
技术背景
[0002]肺癌是临床常见的恶行肿瘤，非小细胞肺癌是肺癌中常见的类型，约占肺癌综述的85％，其发病率和死亡率占恶性肿瘤首位，使用传统治疗手段的效果常常不甚理想，不良反应较大，因此在体外进行肺癌研究，构建癌症模型进行药物筛选成为一种必要趋势。
[0003]TP53蛋白是一种重要的肿瘤抑制因子，是人类癌症中最常发生突变的肿瘤抑制基因，在癌症的发展和治疗中起着基础性和多方面的作用。TP53与其他肿瘤抑制基因不同，p53突变主要作为DNA结合域内的错义突变发生，导致全长突变p53蛋白的表达。突变的p53蛋白不仅失去了它们的肿瘤抑制功能，而且还可能获得新的致癌功能并促进肿瘤发生。这在动物模型中得到了证实，在动物模型中，缺陷的TP53基因会不可避免地导致癌症的发展，而TP53功能的恢复会导致因TP53缺失而启动的已建立肿瘤的消退。
[0004]TP53
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R273H点突变是肿瘤临床中最常见的一种突变，在实验中也发现了R273H突变可以特异性地驱动AKT信号传导并抑制BMF表达，从而提高癌细胞存活率和抗凋亡能力。TP53的突变在癌症中的发生率超过60％，而TP53
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R273H是其中的“热点”突变，在体外实验中p53
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R273H表现出增强肿瘤细胞的增殖、侵袭和耐药性，而且R273H错义突变体还会促使癌细胞产生癌症干细胞。
[0005]肺癌中TP53基因R273H点突变会下调E
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cadherin基因的表达，促进NRP2和NEU1等的表达，促使肿瘤细胞增殖、迁移及发生率上调。构建R273H点突变肺癌细胞株，从模拟癌症迁移侵袭及耐药的角度出发，深入对肺癌发生发展的理解，并可为后期的药物筛选奠定基础。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于构建一种人源肺癌A549细胞TP53基因R273H基因突变细胞模型的方法。
[0007]本申请实施例的技术方案能够将该点突变细胞模型应用于肺癌相关预防、治疗或耐药型药物的研发及筛选。
[0008]为实现本专利技术的目的，采取如下技术方案：
[0009]一种人源肺癌TP53突变细胞模型的构建方法，包括以下步骤：
[0010]设计并构建gRNA，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1，及oligo donor DNA，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
[0011]使用基因编辑方法将肺癌A549细胞模型中的TP53基因R273位点进行定点突变；
[0012]上述人源肺癌TP53基因R273H突变细胞模型的构建方法，所述DNA测序中所用的引物序列分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；
[0013]上述一种人源肺癌TP53基因R273H突变细胞模型在未来临床前药物筛选中的可作为药物处理模型，用于R273H所引起的肺癌药物的研究于开发。
[0014]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0015]本申请的构建方法所构建的人源肺癌TP53基因R273H突变细胞模型，可用于研究TP53基因有害型点突变在肺癌中的作用机制。通过本申请实施例的技术方案，该细胞模型可用作肺癌耐药型药物的筛选及研发，可作为在肺癌致病、治疗等方面研究中稳定的模型存在。
[0016]上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
[0017]下面结合附图和实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。
[0018]需要说明的是：本申请中，“精确度”是指测量或计算的数量(测试报告值)与其实际(或真实)值的符合程度。临床精确度是指真实输出(真阳性(TP)或真阴性(TN)与误分类输出(假阳性(FP)或假阴性(FN))的比例，并且除了别的测量以外，可以表述为灵敏度、特异性、阳性预测值(PPV)或阴性预测值(NPV)、Matheus相关系数(MCC)，或似然度、让步比、接受者操作特性(ROC)曲线、曲线下面积(AUC)。
[0019]对于本申请的诊断性(或预后性)干预，由于各输出(其在疾病分类诊断测试中可能为TP、FP、TN、或FN)承担不同成本，健康经济效用函数可能基于临床情况和个体输出成本和值，优选倾向灵敏度超过特异性，或PPV超过NPV，因此提供健康经济性能和值的另一个测量，该测量可能不同于更直接临床或分析性能测量。这些不同测量和相对折衷一般将仅在具有零误差率的完美测试(也称零预测对象输出误分类或FP和FN)的情况下会聚，所有性能测量将倾向不完美，但程度不同。
[0020]“测量”、“测定”、“检测”或“检查”是指评价临床中给定物质或者对象衍生样品(包含这种物质的定性或定量浓度水平的衍生)的存在、不存在、数量或量(其能是有效量)，或另外评估对象的非分析物临床参数或临床
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决定因素的值或分类。
[0021]本申请上下文中的“样本”是从对象中分离的生物样品，并且能包括，例如但不限于，全血、血清、血浆、口水、黏液、呼吸的空气、尿液、CSF、唾液、汗、粪便、毛发、精液、活检物、鼻液溢、组织活检物、细胞学样品、血小板、网状细胞、白细胞、上皮细胞、或全血细胞。
[0022]本申请所述“治疗”表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。
[0023]本申请上下文中的数据均满足统计学要求(统计学显著)，所谓“统计学显著”指改变大于单独偶然发生可预期(可以是“假阳性”)。统计学显著能用本领域已知的任何方法测定。常用的显著性量度包括p值，其表示至少极限值在给定数据点获得结果的概率，假定该数据点是单独偶然结果。p值是0.05或更小时，通常认为结果显著性高。
[0024]需要说明的是，以下实施例中未注明具体技术或者条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为
可通过正规渠道商购买获得的常规产品。
[0025]具体的，本申请中模型的构建，包括以下步骤：
[0026]图1为本专利技术实施构建人源肺癌A549细胞系TP53基因R273H敲入突变模型的流程图；
[0027]图2为本专利技术中构建突变细胞模型过程中gRNA切割后序列峰值图；
[0028]图3为本专利技术中人源肺癌A549细胞系TP53基因R273H敲入突变成功的细胞模型DNA测序鉴定结果。
[0029]图4为应用本专利技术中人源肺癌A549野生型细胞系与TP53基因R273H敲入突变细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建人源肺癌A549细胞TP53基因R273H位点突变模型的序列及突变位点检测引物，其特征在于：人源TP53基因R273H位点突变所用gRNA的设计构建，及特异性同源重组载体(donor DNA)的设计构建。gRNA序列为：gRNA：5
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ACTGGGACGGAACAGCTTTGAGG
‑3’
。2.将gRNA与载体进行连接，酶切后获得oligo donor DNA序列，作为R273H突变型细胞的同源臂片段，其序列为：oligo donor DNA：GCTTCTCTTTTCCTATCCTGAGTAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAAGTGCATGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGAAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：田静，杨进，王志浩，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：