一种体外构建有序微孔仿生神经导管的方法及应用技术

本发明专利技术公开一种体外构建有序微孔仿生神经导管的方法及应用，通过熔融拉丝法制备微米级纤维丝，挑选直径规格相似的纤维丝并捆扎修剪成束，向纤维丝束中滴加可分泌细胞外基质的细胞，将其置于培养瓶中或灌流生物反应器中培养，最终可形成细胞外基质包裹的组织块。通过有机溶剂将高分子材料溶解，再脱细胞处理后即可获得有序微孔仿生神经导管。制得的有序微孔仿生神经导管在结构上与天然神经脱细胞基质十分接近；神经导管形状由纤维丝决定，可捆扎成直条型、Y型或三叉型等多种形状；可实现动物或人体内的神经组织不同损伤情况下的修复，适用范围较大。用范围较大。用范围较大。

【技术实现步骤摘要】
一种体外构建有序微孔仿生神经导管的方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其是涉及一种体外构建有序微孔仿生神经导管的方法及应用。

技术介绍

[0002]中枢神经损伤和外周神经损伤是严重的创伤，常常造成患者永久性的肢体感觉或运动障碍。全球每年有超70万人罹患脊髓损伤，有超200万人罹患外周神经损伤。尽管医学技术不断的发展，但临床上仍然无有效的方法治疗脊髓损伤及外周神经损伤。对于严重的脊髓损伤及周围神经缺损性疾病，替代治疗及自体神经移植是一种新的方法。但自体神经及自体细胞移植存在来源有限，取材部位存在二次损伤。随着组织工程技术的不断发展，构建用于脊髓损伤及周围神经缺损修复的桥接导管是目前的研究热点。神经导管在一定程度上成为桥接神经缺损的关键支架，导管应当具备一定的神经再生引导作用，应当具备与神经组织相似的结构及活性成分。
[0003]神经组织的结构与其他组织有所不同，轴突被髓鞘和外层的神经内膜包裹形成单个神经纤维，多条神经纤维被神经束膜包裹形成神经束。神经组织的脱细胞结构为有序的微孔结构。因此基于仿生学的原理，神经导管的制备应当从结构和成分两个角度都做到与正常神经接近，才可能获得较好的修复效果。
[0004]目前研究的神经导管材料较多，有用天然材料和人工合成材料制备神经导管，例如一型胶原、壳聚糖、透明质酸、海藻酸钠、丝素、纤维蛋白、聚乳酸
‑
乙醇酸共聚物(PLGA)，聚已内酯(PCL)、聚L
‑
丙交酯
‑
己内酯(PLCL)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)等。目前神经导管制备的方法有静电纺丝法、冷冻干燥法和3D打印法等。静电纺丝尽可以制备单孔的神经导管，无法制备微孔多阵列的导管。冻干法制备的神经导管能够具有微孔的结构，但微孔的有序性较差，并且力学性能较差、往往需要化学交联才能增强力学性能。3D打印方式制备的导管对材料要求比较高，很多材料打印精度较差，最高的打印精度只能到200μm，而且孔壁较厚，单位面积内并不能形成多个孔道，无法制备成微通道的结构。目前静电纺丝法、冷冻干燥法和3D打印法制备导管尽管可选用神经组织特异性胞外基质蛋白成分，但仅可做到胞外基质蛋白的物理堆积，无法做到胞外基质有序的生物重构，这样物理方法形成的胞外基质蛋白底物与细胞分泌并重塑的胞外基质底物功能相差甚远。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种体外构建有序微孔仿生神经导管的方法及应用。
[0006]本专利技术采用的技术方案是：一种体外构建有序微孔仿生神经导管的方法，包括，
[0007]制备纤维丝，困扎修剪成束；
[0008]将纤维丝束置于体外培养环境中，持续或多次间隔向纤维丝束上滴加可分泌细胞外基质的细胞，以纤维丝束为模板形成纤维丝束
‑
细胞复合物；
[0009]将纤维丝束
‑
细胞复合物取出，溶解纤维丝、脱细胞后形成有序微孔仿生神经导管。
[0010]优选地，体外培养环境为培养瓶、灌流式生物反应器或微流控器官芯片。
[0011]优选地，可分泌细胞外基质的细胞包括各种组织来源的成纤维细胞、各种组织来源的平滑肌细胞、各种组织来源的上皮细胞、各种组织来源的间质细胞、各种组织来源的干细胞、内皮细胞、纤维母细胞、成骨细胞、成骨细胞前体细胞、牙周膜细胞、牙周韧带细胞、滑膜细胞、肌腱细胞、软骨细胞、角质形成细胞、支持细胞、Leydig细胞、肾小球系膜细胞、雪旺细胞、星形胶质细胞、嗅鞘细胞、肿瘤相关成纤维细胞、神经鞘瘤细胞、软骨肉瘤细胞、神经纤维瘤细胞、神经母细胞瘤细胞、神经胶质瘤细胞、神经星形胶质母细胞瘤细胞、神经上皮瘤细胞、黑色素瘤细胞、子宫内膜癌细胞、子宫肌瘤细胞、食道癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、喉癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞中的一种或多种的组合。
[0012]优选地，对可分泌细胞外基质的细胞进行体外扩增，滴加到纤维丝束上，每立方厘米纤维丝束中总滴加细胞量为1
×
106‑1×
109；
[0013]优选地，将粘附有细胞的纤维丝束体外培养14
‑
72天。
[0014]优选地，体外培养环境中的培养基中加入体外培养环境中的培养基中加入成纤维细胞生长因子(FGF)、层粘连蛋白(Laminin)、纤维连接蛋白、结缔组织生长因子(CTGF)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子3(NT
‑
3)，神经营养因子4(NT
‑
4)、胶质细胞源神经营养因子(GDNF)、脑源神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、转化生长因子(TGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板源生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF
‑Ⅰ
)、角质化细胞生长因子(KGF
‑
2)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)中的一种或多种。
[0015]优选地，纤维丝为单根的聚乳酸
‑
乙醇酸共聚物(PLGA)，聚已内酯(PCL)、聚L
‑
丙交酯
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己内酯(PLCL)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、左旋聚乳酸(PLLA)、超支化聚乳酸(HPLA)、聚羟基脂肪酸酯(PHA)、聚对苯二甲酸
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1,4
‑
环己烷二甲醇酯(PCTG)、聚对苯二甲酸乙二醇酯
‑
1,4
‑
环己烷二甲醇酯(PETG)、环己烷二甲醇共聚聚酯(PCTA)、聚碳酸酯(PC)、聚氨酯(PU)或丙烯酸树脂的一种或多种的混合物；
[0016]优选地，纤维丝束困扎成线形、Y型、三叉型或中心设置截面蝴蝶型的硅胶模具。
[0017]优选地，采用熔融拉丝方式制备纤维丝，不使用有机溶剂。
[0018]优选地，采用三氯甲烷、二氯甲烷、甲苯、丙酮或六氟异丙醇溶解纤维丝束
‑
细胞中的纤维丝；
[0019]采用十二烷基硫酸钠(SDS)、Triton X
‑
100、Triton X
‑
200、脱氧胆酸钠、硫代甜菜碱10或硫代甜菜碱16脱除组织块中的细胞；
[0020]优选地，采用DNA酶和/或RNA酶脱核酸。
[0021]体外构建有序微孔仿生神经导管的方法制备得到的有序微孔仿生神经导管。
[0022]有序微孔仿生神经导管在制备外周神经修复材料或脊髓修复材料中的应用。
[0023]本专利技术具有的优点和积极效果是：通过将直径相似的纤维丝捆扎成束，成为细胞分泌胞外基质的模板和底物，对纤维丝束滴加细胞后再利用培养瓶中或灌流生物反应器的体外培养条件，能够较体内环境下进一步刺激细胞的增殖及细胞外基质的分泌，降低了构建的组织块的免疫原性；最终形成了纤维丝
‑
组织块复合物，通过有机溶剂去除纤维丝模板而不溶解胞外基质的特点，成功的制成了有序微孔神经导管；制得的有序微孔仿生神本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外构建有序微孔仿生神经导管的方法，其特征在于：包括，制备纤维丝，困扎修剪成束；将纤维丝束置于体外培养环境中，持续或多次间隔向纤维丝束上滴加可分泌细胞外基质的细胞，以纤维丝束为模板形成纤维丝束
‑
细胞复合物；将纤维丝束
‑
细胞复合物取出，溶解纤维丝、脱细胞后形成有序微孔仿生神经导管。2.根据权利要求1所述的体外构建有序微孔仿生神经导管的方法，其特征在于：体外培养环境为培养瓶、灌流式生物反应器或微流控器官芯片。3.根据权利要求1所述的体外构建有序微孔仿生神经导管的方法，其特征在于：可分泌细胞外基质的细胞包括各种组织来源的成纤维细胞、各种组织来源的平滑肌细胞、各种组织来源的上皮细胞、各种组织来源的间质细胞、各种组织来源的干细胞、内皮细胞、纤维母细胞、成骨细胞、成骨细胞前体细胞、牙周膜细胞、牙周韧带细胞、滑膜细胞、肌腱细胞、软骨细胞、角质形成细胞、支持细胞、Leydig细胞、肾小球系膜细胞、雪旺细胞、星形胶质细胞、嗅鞘细胞、肿瘤相关成纤维细胞、神经鞘瘤细胞、软骨肉瘤细胞、神经纤维瘤细胞、神经母细胞瘤细胞、神经胶质瘤细胞、神经星形胶质母细胞瘤细胞、神经上皮瘤细胞、黑色素瘤细胞、子宫内膜癌细胞、子宫肌瘤细胞、食道癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、喉癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞中的一种或多种的组合。4.根据权利要求3所述的体外构建有序微孔仿生神经导管的方法，其特征在于：对可分泌细胞外基质的细胞进行体外扩增，滴加到纤维丝束上，每立方厘米纤维丝束中总滴加细胞量为1
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109；优选地，将粘附有细胞的纤维丝束体外培养14
‑
72天。5.根据权利要求3所述的体外构建有序微孔仿生神经导管的方法，其特征在于：体外培养环境中的培养基中加入成纤维细胞生长因子(FGF)、层粘连蛋白(Laminin)、纤维连接蛋白、结缔组织生长因子(CTGF)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子3(NT
‑
3)，神经营养因子4(NT
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4)、胶质细胞源神经营养因子(GDNF)、脑源神经营养因子(BDNF...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱雷，郝定均，陈宁，贾帅军，
申请(专利权)人：朱雷，
类型：发明
国别省市：