一种大麻二酚半抗原、人工抗原以及单克隆抗体和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种大麻二酚半抗原、人工抗原、抗体及和应用，在保留大麻二酚基本结构的基础上引入连接臂和用于偶联大分子的活性基团获得半抗原；通过活化酯法将半抗原与载体蛋白偶联制备人工抗原，偶联比达12，再以人工抗原免疫动物制备获得针对大麻二酚的特异性好、灵敏度高的单克隆抗体，基于该抗体所建立的检测大麻二酚的免疫分析方法，其IC

【技术实现步骤摘要】
一种大麻二酚半抗原、人工抗原以及单克隆抗体和应用


[0001]本专利技术属于生物化工
，具体涉及一种大麻二酚半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]大麻二酚(cannabidiol,CBD)是一种非精神活性大麻素，存在于工业大麻中，不具有成瘾性。现代药理学证明,大麻二酚具有诸如抗癫痫、抗焦虑、镇静等多种药理学活性,表明大麻二酚是一种具有广阔应用前景的活性天然产物。在工业大麻的种植及加工过程中,CBD不断累积和代谢。CBD化学性质不稳定,现有研究表明，CBD在酸性条件下可转化为成瘾性物质四氢大麻酚(Michal P.Dybowski,Andrzej L.Dawidowicz,Rafal Typek,Michal Rombel.Conversion of cannabidiol(CBD)toΔ9
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tetrahydrocannabinol(Δ9
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THC)during protein precipitations prior to plasma samples analysis by chromatography
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Troubles with reliable CBD quantitation when acidic precipitation agents are applied.Talanta,2020,220:121390)，造成食品安全隐患。因此，开发快速准确的大麻二酚检测手段和方法对于指导工业大麻种植及加工具有重要意义。/>[0003]免疫分析是一种基于抗原抗体特异性识别和结合反应的分析方法，具有灵敏度高、操作简单、对仪器要求及成本低等优点。大麻二酚属于分子量小于1000的小分子化合物，本身不具备反应性和免疫原性，为了实现大麻二酚的免疫检测，不仅需要合成具备高效价的大麻二酚抗原，而且还需要筛选特异性强、敏感度高的大麻二酚单克隆抗体，但是目前鲜见大麻二酚单克隆抗体的相关报道，对于技术人员来说高效价的大麻二酚抗原的设计仍是难点。

技术实现思路

[0004]为克服现有技术存在的上述的缺陷，提供如下的技术方案：
[0005]针对现有技术不足，本专利技术提供了一种可用于大麻二酚检测的半抗原和人工抗原及其制备方法。本专利技术半抗原在保留大麻二酚基本结构的基础上引入连接臂和用于偶联大分子的活性基团，本专利技术通过活化酯法将半抗原与载体蛋白偶联制备人工抗原，利用该大麻二酚完全抗原制备的抗大麻二酚抗体特异性好，灵敏度高，并且与
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9THC无交叉反应，可以用于制备检测大麻二酚的试剂或试剂盒，建立大麻二酚免疫学检测方法，实现大麻二酚的准确检测。
[0006]本专利技术所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
[0007]本专利技术提供了一种大麻二酚半抗原，其分子结构式如式I所示：
[0008][0009]本专利技术还提供了式I所示大麻二酚半抗原的制备方法，包括如下步骤：
[0010]大麻二酚与丁二酸酐反应，得到大麻二酚半抗原。
[0011]作为优选，大麻二酚与丁二酸酐反应的溶剂为中性或弱碱性溶剂，反应的温度为40～70℃，反应的时间为10～28h。
[0012]在本专利技术提供的实施例中，大麻二酚与丁二酸酐反应的溶剂为吡啶。
[0013]作为优选，大麻二酚与丁二酸酐的质量比为(1:2～4)。
[0014]本专利技术还提供了一种大麻二酚人工抗原，其分子结构式如式Ⅱ所示：
[0015][0016]本专利技术还提供了式Ⅱ所示大麻二酚人工抗原的制备方法，其采用活化酯法制备大麻二酚人工抗原。
[0017]在本专利技术提供的实施例中，大麻二酚人工抗原制备方法包括如下步骤：
[0018]将本专利技术提供的大麻二酚半抗原与EDC、NHS在有机溶剂中反应，得到A液；
[0019]将载体蛋白与磷酸盐缓冲液混合，得到B液；
[0020]A液与B液反应，得到大麻二酚人工抗原。
[0021]作为优选，有机溶剂选择DMF。
[0022]作为优选，大麻二酚半抗原、EDC、NHS在有机溶剂中反应的条件为2～30℃、避光条件下搅拌反应2～28h。
[0023]作为优选，所述A液与所述B液反应具体为：将A液滴入B液，在2～10℃、避光条件下搅拌反应2～20h。
[0024]作为优选，大麻二酚半抗原、EDC、NHS的质量比为1：(1～5)：(2～6)。
[0025]优选地，大麻二酚半抗原、EDC、NHS的质量比为1：2：2。
[0026]作为优选，载体蛋白与大麻二酚半抗原的质量比为1：(15～25)。
[0027]作为优选，载体蛋白为牛血清白蛋白BSA。
[0028]在本专利技术提供的实施例中，将A液按4秒/滴加入B液，在4℃、避光条件下搅拌反应6h。
[0029]本专利技术提供了大麻二酚半抗原、人工抗原及其制备方法。大麻二酚半抗原的分子结构式如式I所示，其人工抗原的分子结构式如式Ⅱ所示。本专利技术的有益效果为：
[0030]本专利技术以大麻二酚为原料，与丁二酸酐反应，得到羧基化的大麻二酚半抗原。该半
抗原在保留大麻二酚基本结构的基础上引入连接臂和用于偶联大分子的活性基团，这样既有利于其与大分子偶联，又可以在偶联后充分暴露本身分子结构和分子量(314)较小的大麻二酚基本结构，避免了其被大分子掩蔽而影响动物机体的识别。
[0031]本专利技术通过活化酯法将半抗原与蛋白质偶联制备人工抗原，偶联比可达12，可用于大麻二酚的免疫检测。
[0032]本专利技术提供了一种抗大麻二酚抗体，由上述方案所述大麻二酚完全抗原制备得到。
[0033]本专利技术将大麻二酚完全抗原免疫宿主动物，从所述宿主动物中分离脾细胞，在体外将所述脾细胞与SP2/0瘤细胞融合，筛选能够分泌抗大麻二酚抗体的杂交瘤细胞株，基于所述杂交瘤细胞株制备抗大麻二酚抗体(或抗大麻二酚的血清)，能够与大麻二酚特异性结合，具有较好的免疫效果。本专利技术对所述宿主动物的种类没有特殊限定，本领域技术人员熟知的宿主动物均可。本专利技术对所述分离脾细胞，将所述脾细胞与SP2/0瘤细胞融合，筛选能够分泌抗大麻二酚抗体的杂交瘤细胞株以及基于所述杂交瘤细胞株制备抗大麻二酚抗体的具体方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方法即可。本专利技术优选通过采用不同的宿主动物得到不同的抗大麻二酚抗体，具体的，以小鼠为宿主动物，可以得到单克隆抗体；以兔子或山羊为宿主动物，可以得到多克隆抗体；以骆驼或羊驼为宿主动物，可以得到纳米抗体。在本专利技术的实施例中，具体是以小鼠为宿主动物，最终得到单克隆抗体。
[0034]作为优选的，所述的单克隆抗体为CGMCC No.45314的杂交瘤细胞株分泌获得，所述的杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0035]作为优选的，其中所述抗体的重链可变区的HCDR1氨基酸序本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大麻二酚半抗原，其特征在于，其分子结构式如式I所示：2.一种大麻二酚人工抗原，其特征在于，其分子结构式如式Ⅱ所示：。3.如权利要求2所述大麻二酚人工抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将权利要求1所述的大麻二酚半抗原与EDC、NHS在有机溶剂中反应，得到A液；2)将载体蛋白与磷酸盐缓冲液混合，得到B液；3)所述A液与所述B液反应，得到所述大麻二酚人工抗原。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述大麻二酚半抗原、EDC、NHS在有机溶剂中反应的条件为2～30℃、避光条件下搅拌反应2～28h。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述A液与所述B液反应具体为：将A液滴入B液，在2～10℃、避光条件下搅拌反应2～20h。6.一种特异性识别大麻二的酚的抗体，其特征在于，其是单克隆抗体，由保藏号为CG...

【专利技术属性】
技术研发人员：王凤忠，孙玉凤，范蓓，祝冬，佟立涛，孙晶，卢聪，白亚娟，李敏敏，李春梅，
申请(专利权)人：中国农业科学院农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：