一种石斛KNOX类转录因子基因DoSTM及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种石斛KNOX类转录因子基因DoSTM及其应用。转录因子DoSTM或其编码基因DoSTM在调控植物种子在石斛类原球茎增殖中的应用，所述的转录因子DoSTM的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术从铁皮石斛类原球茎中克隆得到的属于石斛KNOX转录因子DoSTM的编码基因KNOX转录因子基因DoSTM，KNOX转录因子DoSTM作为正调控因子参与了调控石斛类原球茎的增殖，通过转基因及功能鉴定证实超量表达KNOX转录因子DoSTM，转基因石斛的增殖能力显著提高。因此，KNOX转录因子DoSTM或其编码基因在兰科植物微体繁殖、遗传转化和细胞工程等领域具有重要的理论意义及应用价值。重要的理论意义及应用价值。重要的理论意义及应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种石斛KNOX类转录因子基因DoSTM及其应用

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[0001]本专利技术属于植物领域，具体涉及KNOX转录因子或其编码基因及其在调控兰科植物类原球茎发育中的应用。

技术介绍
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[0002]兰科是植物第二大科，具有重要商业价值、药用价值和观赏价值。其中蝴蝶兰属、兜兰属和卡特兰属的植物具有显著的观赏价值(Cardoso et al.,2020)，而石斛属等被用作草药，治疗一些慢性疾病如糖尿病和肿瘤等，具有重要的药用价值(张等，2017)。《中华人民共和国药典》(2020年版)收录的石斛有金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl.)、霍山石斛(D.huoshanense)鼓槌石斛(D.chrysotoxum Lindl)、流苏石斛(D.fimbriatum Hook)和铁皮石斛(D.officinale Kimum et Migo)。目前，我国多省市已经开展了铁皮石斛药食同源试点，将会进一步促进石斛产业的快速发展。目前，以石斛为原料开发成的产品有药品、保健品和化妆品，产值超过百亿人民币。
[0003]兰科植物的种子不含胚乳，结构非常简单。在萌发时，胚发育成球形结节状体，称为原球茎，并在顶端形成芽顶端分生组织。类原球茎是形态跟原球茎相似，由原球茎或其它外植体在离体培养条件下诱导得到，具有较强的增殖能力，亦可分化成苗，保持母体的优良特性。类原球茎在植物发育生物学、植株高效再生、遗传转化、次生代谢物质生产、细胞工程等研究领域均有广泛的应用前景。但是，兰花建立这种独特的、无与伦比的发育过程的分子机制仍是不清楚的。PLB的细胞学特征和细胞壁标记物与合子胚发育相似，被认为是兰科的体胚(Lee et al.,2013)。但是，研究表明一些与体胚形成的标记基因如SERK2、BBM2、CLV2、WOX并未在兜兰的PLBs阶段呈现高表达(Guo et al.,2021)。研究发现蝴蝶兰的原球茎、PLB与合子胚发育的分子机制存在差异，PLB再生并不按照胚胎发生的程序(Fang et al.,2016)。这说明兰科植物的PLB发育机有区别于植物体胚发生。

技术实现思路
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[0004]本专利技术的目的是提供转录因子DoSTM或其编码基因及其在调控兰科植物类原球茎增殖中的应用。
[0005]本专利技术从铁皮石斛类原球茎中克隆得到铁皮石斛KNOX转录因子DoSTM的编码基因KNOX转录因子基因DoSTM，KNOX转录因子DoSTM作为正调控因子参与了石斛类原球茎发育，通过转基因及功能鉴定证实超量表达KNOX转录因子DoSTM，促进转基因石斛的类原球茎形成。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供转录因子DoSTM，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供一种编码转录因子DoSTM的编码基因DoSTM。
[0008]所述的编码基因DoSTM，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]本专利技术的第三个目的是提供了转录因子DoSTM或其编码基因DoSTM在调控石斛类原球茎增殖中的应用，所述的转录因子DoSTM的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]优选，是在石斛中超表达转录因子DoSTM的编码基因提高转基因类原球茎增殖的应用。
[0011]所述的转录因子DoSTM的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0012]所述的石斛是铁皮石斛。
[0013]本专利技术从铁皮石斛类原球茎中克隆得到的属于铁皮石斛KNOX转录因子DoSTM的编码基因KNOX转录因子基因DoSTM，KNOX转录因子DoSTM作为正调控因子参与了石斛类原球茎增殖，通过转基因及功能鉴定证实超量表达KNOX转录因子DoSTM，转基因类原球茎的增殖能力提高。因此，KNOX转录因子DoSTM或其编码基因在兰科植物的微体快繁、遗传转化和细胞工程等领域均有重要的理论指导意义及应用价值。
附图说明：
[0014]图1是DoSTM全长，其中1为DL2000 DNA Marker，2是没有加cDNA模板的阴性对照，3为DoSTM目的片段。
[0015]图2是DoSTM在不同发育阶段的表达模式分析，1是类原球茎；2是从类原球茎诱导的芽。
[0016]图3是DoSTM亚细胞定位分析。
[0017]图4是荧光定量PCR分析表明DoSTM基因在超表达石斛株系中的表达水平；其中WT为野生型石斛，DoSTM
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OX表示为筛选到的DoSTM超表达转基因石斛。
[0018]图5是野生型和DoSTM超表达石斛类原球茎在不含植物生长调节剂培养基上的增殖情况；其中WT为野生石斛，DoSTM
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OX表示为筛选到的DoSTM超表达转基因石斛。
[0019]图6是pSAT6
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EYFP
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N1载体的载体图谱。
具体实施方式：
[0020]以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是本专利技术的限制。
[0021]实施例1
[0022]下列实施例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》、F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》中所述条件，或按照所用产品生产厂商的使用说明。
[0023]实施例中所用石斛保存在中国科学院华南植物园组织培养室内。选取类原球茎为材料提取RNA。逆转录酶M
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MLV购自Promega公司，其货号为：M1701；DNase I(RNase Free)购自宝日医生物技术(北京)有限公司(TaKaRa中国)，其货号为D2215；普通PCR反应buffer为2
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TSINGKE Master Mix(blue)购自擎科生物公司，其货号为TSE004
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5ML；构建超表达载体采用高保真酶进行扩增，所用的高保真酶为KOD
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401，购自东洋纺(上海)生物科技有限公司，其货号为：KOD
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401；pMD18
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T载体和Nco I酶均购自宝日医生物技术(北京)有限公司(TaKaRa中国)，其货号分别为D101A和1160BH；MS和LB培养基为本领域常用培养基，其配方参考J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。
[0024]以SDS法提取石斛类原球茎RNA，提取得到的RNA用DNase I进行去基因组DNA处理，具体操作按照使用说明书进行。得到的纯化后的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，检测RNA的完整
性；然后在超微量核酸蛋白测定仪NanoDrop2000检测RNA的浓度和纯度，检测合格的RNA置于
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80℃冰箱备用。采用Promega公司逆转录酶M
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MLV进行逆转录得到cDNA。在铁皮石斛全基因组CDS拼接文件中查找得到DoSTM的CDS核苷酸序列，根据序列信息设计正本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.转录因子DoSTM，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.一种编码权利要求1所述的转录因子DoSTM的编码基因DoSTM。3.根据权利要求2所述的编码基因DoSTM，其特征在于，所述的编码基因DoSTM，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.权利要求1所述的转录因子DoSTM或其编码基因DoSTM在调控石斛类...

【专利技术属性】
技术研发人员：何春梅，段俊，曾丹琦，司灿，
申请(专利权)人：中国科学院华南植物园，
类型：发明
国别省市：