本发明专利技术公开了特异性抑制长链非编码RNAAI662270表达的shRNA在制备治疗肾纤维化药物或慢性肾病中的应用。非编码RNAAI662270在小鼠肾脏中过表达后能促进小鼠肾纤维化的发生。在结扎的小鼠肾脏中抑制lncRNAAI662270的表达可以缓解小鼠肾纤维化的发生，为肾纤维化的治疗提供了一个新的靶点。化的治疗提供了一个新的靶点。化的治疗提供了一个新的靶点。
【技术实现步骤摘要】
特异性抑制lncAI662270表达的shRNA在制备治疗肾纤维化药物中的应用
[0001]本专利技术涉及特异性抑制lncRNA AI662270表达的shRNA在制备治疗肾纤维化药物中的应用。
技术介绍
[0002]世界上超过10％的成年人口患有慢性肾病。慢性肾病虽然进展缓慢，但发展为终末期肾病后便成为危害人类健康、耗费社会医疗资源的慢性病。这也表明当前治疗方法效果有限，只能延缓疾病进展。肾纤维化是各种慢性肾病的共同病理学特征，主要表现为肾小球硬化、肾小管萎缩、肾小管间质纤维化、炎症细胞浸润和肾小管微血管损失等。纤维化发生时会使细胞外基质过度沉积，肾小球系膜、小管间质和鲍曼囊中纤维连接蛋白表达增加[1,2]。纤维化间质病变面积与肾功能及远期预后密切相关。在肾组织中纤维化可发生在肾小球，称为肾小球硬化，也可发生在小管，称为小管间质纤维化[3，4]。目前临床上缺少针对肾纤维化的有效治疗方法，因此，亟需开发新的治疗方法来逆转疾病进展。
技术实现思路
[0003]本专利技术的目的是提供特异性抑制lncRNA AI662270(长链非编码RNA AI662270)表达的shRNA在制备治疗肾纤维化药物中的应用，其中lncRNA AI662270的正义链序列如SEQ ID No.1所示。特异性抑制lncRNA AI662270表达的shRNA的序列如SEQ ID No.2所示。
[0004]本专利技术的另一目的是提供特异性抑制lncRNA AI662270表达的shRNA在制备治疗慢性肾病药物中的应用。特异性抑制lncRNA AI662270表达的shRNA的序列如SEQ ID No.2所示。
[0005]有益效果：lncRNA AI662270在小鼠肾脏中过表达后能促进小鼠肾纤维化的发生。在结扎的小鼠肾脏中抑制lncRNA AI662270的表达可以缓解小鼠肾纤维化的发生，为肾纤维化的治疗提供了一个新的靶点。
附图说明
[0006]图1qRT
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PCR验证小鼠纤维化模型中lncRNAAI662270的表达。
[0007]图2在小鼠肾组织中过表达lncRNAAI662270。
[0008]图3小鼠肾纤维化模型中敲低lncRNA AI662270的表达。
[0009]图中的符号说明如下：
[0010]UUO(Unilateral Uretera Obstruction)模型，指单侧输尿管梗阻模型
[0011]IRI(Ischemia
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reperfusionInjury)模型，指缺血再灌注模型
[0012]DN(Diabetic Nephropathy)模型，糖尿病肾病模型
[0013]Sham，指假手术组
[0014]字母d和day指带日期天数
[0015]12W和14W指12周和14周
[0016]HE(hematoxylin
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eosin staining)染色，指苏木精
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伊红染色法
[0017]Masson染色，指马松染色
[0018]pCI指空载质粒
[0019]pCI
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AI662270指过表达AI662270质粒
[0020]Acta2是指一种肌动蛋白，有多个别名，包括α
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肌动蛋白、α
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肌动蛋白
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2、主动脉平滑肌或α平滑肌肌动蛋白(α
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SMA)
[0021]ColⅠ指Ⅰ型胶原
[0022]GAPDH指内参
[0023]UUO+shNC指在肾纤维化小鼠肾组织中递送NC质粒
[0024]UUO+AI662270shRNA指在肾纤维化小鼠肾组织中递送敲低AI662270质粒。
具体实施方式
[0025]下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。
[0026]引物列表
[0027][0028][0029]抗体列表
[0030][0031]材料方法
[0032]1、超声介导质粒递送到肾脏
[0033]构建lncAI662270过表达质粒，首先提取小鼠组织总RNA，逆转录为cDNA备用。根据NCBI上lncAI662270的cDNA序列设计引物扩增lncAI662270，琼脂糖凝胶验证目的片段大小并胶回收。利用同源重组方法将目的片段连接到含有CMV启动子的真核表达载体pCI上。将得到的菌落平板进行菌落PCR验证，验证正确的通过摇菌提质粒后送往生工生物工程有限公司测序，最终得到pCI
‑
AI662270质粒。lncAI662270shRNA/shNC质粒载体为pGPU6/GFP/Neo，靶序列为5
’‑
gctgtagattgctggtaatgt
‑3’
(SEQ ID No.9)上海吉玛制药技术有限公司
合成。
[0034]其中lncAI662270的序列如SEQ ID No.1所示，构建到lncAI662270shRNA质粒中的shDNA的序列如SEQ ID No.2所示。通过超声介导的方法将质粒递直接递送到肾脏从而实现在肾脏中过表达和敲低目的基因。分别准备浓度为2μg/μL的pCI、pCI
‑
AI662270、lncAI662270shRNA、lncAI662270shNC质粒。质粒和注射用六氟化硫微泡按体积比1：1混合。通过尾静脉注射200μL上述混合物。同时用剃毛器剃干净小鼠左侧肾脏部位，暴露表面皮肤，涂抹耦合剂后持续超声5min，超声频率设置为输出功率1W。其中pCI、pCI
‑
AI662270质粒每周递送一次到野生型小鼠的左侧肾脏，周期为两个月。在UUO模型诱导小鼠肾纤维化模型敲低lncAI662270的实验中，手术后立即将lncAI662270 shNC、lncAI662270 shRNA质粒递送到肾脏，7天后收样。
[0035]2、蛋白质免疫印迹实验
[0036](1)组织蛋白提取(2)制备SDS
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聚丙烯酰胺凝胶(3)封闭和抗体孵育。
[0037]3、实时荧光定量PCR实验
[0038](1)RNA提取(2)Real
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time qPCR实验：取1μgRNA使用诺维赞III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)试剂盒逆转录体系将RNA逆转录得到cDNA。qPCR实验使用诺维赞qPCR Master Mix(High ROX Premixed)染料法定量PCR检测试剂盒检测基因表达量变化。
[0039]4、病理分析
[0040]首先收取的小鼠肾脏组织用石蜡包埋的方法保存备用。(1)HE染色：首先组织样本脱蜡水化，将水化完的切片置于苏木精染色液中3min，再用ddH2本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.特异性抑制lncRNAAI662270表达的shRNA在制备治疗肾纤维化药物中的应用，其中lncRNAAI662270的正义链序列如SEQ ID No.1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述lncRNA AI662270的靶序列如SEQ ID No.9所示。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述特异性抑制lncRNAAI662270表达的shRNA的序列如SEQ ID No.2所示。4.特异...
【专利技术属性】
技术研发人员：张峻峰，孙岩岩，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：
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