克服白桦自交不亲和性的试剂及用法和应用制造技术

本发明专利技术属涉及一种克服白桦自交不亲和性的试剂及用法和应用，本发明专利技术涉及白桦育种技术领域，该方法主要以白桦雌花序为实验材料，在含有100μM

【技术实现步骤摘要】
克服白桦自交不亲和性的试剂及用法和应用


[0001]本专利技术涉及白桦的育种
，更特别地，涉及一种克服白桦自交不亲和性的试剂及用法和应用。

技术介绍

[0002]白桦(BetμLa platyphylla Suk.)是一种分布于我国东北地区的纸浆木树种，也是最具经济效益的生态修复树种之一。为了提高白桦的遗传增益和扩大经济利益，一个策略是对白桦进行遗传改良，但是白桦具有严格的自交不亲和性现象，即一种阻止自花授粉，促进异花授粉的授粉机制。
[0003]因此在白桦育种时为了保存其优良性状，主要通过无性繁殖技术获得新品种个体。中国专利公开号CN114836468A，公开日2022年8月2日，专利技术的名称为一种高效的白桦根转基因方法，该申请公开了利用组培技术将白桦组培苗的根繁殖成白桦幼苗的方法，但不足之处是操作复杂、效率较低、耗时久。于是，克服白桦自交不亲性是解决当前问题的一个简易方法。
[0004]目前，自交不亲和分为配子体自交不亲和(gametophyte self
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incompatibility，GSI)和孢子体自交不亲和(sporophytic self
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incompatibility，SSI)两种类型。配子体型自交不亲和性的授粉阻断发生在配子体之间，即花粉萌发后花粉管能在花柱组织中延伸一段，此后就受到抑制；孢子体型自交不亲和性的不亲和关系发生在花粉管与柱头乳突细胞的孢子体之间，即花粉在柱头上不能萌发或萌发后无法侵入柱头。
[0005]在克服芸薹属、萝卜属等孢子体型自交不亲和植物的研究中，有研究发现植物活性氧(Reactive oxygen species，ROS)参与植物授粉过程，中国专利公开号CN112042670A，公开日2020年12月8日，专利技术的名称为克服芸薹属与萝卜属自交不亲和性的试剂及用法和应用，该申请公开了利用ROS清除剂碘化钾可以克服芸薹属、萝卜属植物的孢子体自交不亲和性。
[0006]但是目前在配子体自交不亲和研究中，特别是在白桦育种研究中，没有克服白桦自交不亲和性方法的相关报道，因此需要寻找一种高效、简单、具有广谱性的克服白桦自交不亲和性的方法，解决当前白桦育种和遗传改良中遇到的问题。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于针对现有白桦遗传育种中存在的问题，本专利技术公开了一种克服白桦自交不亲和性的试剂及用法和应用。
[0008]一种克服白桦自交不亲和性的试剂，所述试剂为植物活性氧抑制剂氯化二亚苯基碘(Diphenyleneiodonium chloride，DPI)，在PGM固体培养基中的终浓度为100μM
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500μM。
[0009]本专利技术公开的克服白桦自交不亲和性的试剂氯化二亚苯基碘的用法，其特征在于，步骤如下：
[0010]1)配置的PGM固体培养基，包含DPI试剂的终浓度为100μM
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500μM；
[0011]2)分离雌花，快速移植到步骤1配置的PGM固体培养基中进行培养；
[0012]3)预培养4h后用授粉刷授粉，雌花再在PGM固体培养基中培养24h，让花粉管充分生长；
[0013]4)使用苯胺蓝染色法来检测花粉管生长情况。
[0014]所述的克服白桦自交不亲和性的试剂氯化二亚苯基碘的用法，步骤1)配置组分为5mM氯化钙、5mM氯化钾、0.01％硼酸、1mM硫酸镁、10％蔗糖的PGM液体培养基，高压高温灭菌后，在超净工作台进行分装，4℃保存。实验时，在PGM液体培养基中加入1％琼脂糖，金属浴100℃加热溶解。溶解充分后，待PGM固体培养基降温至50℃至60℃时，加入氯化二亚苯基碘溶液混匀。如从浓度为10mM DPI溶液里分别吸取10μL、20μL、50μL分别加入溶解充分的1mL PGM固体培养基中混匀(对照组培养基中加50μL DMSO)。然后吸取300μL PGM固体培养基放置在5mL离心管管盖内，待培养基凝固备用。
[0015]所述的克服白桦自交不亲和性的试剂氯化二亚苯基碘的用法，步骤2)通过显微镜一边观察，一边使用尖头镊子将雌花轻轻从主花序上分离，分离后快速移到PGM固体培养基中进行培养。注意只需让雌花子房部分浸没在培养基中即可。
[0016]所述的克服白桦自交不亲和性的试剂氯化二亚苯基碘的用法，步骤3)准备一个新的培养皿，在底部放置滤纸并加入适量水，再将装有培养基和雌花的管盖放入培养皿中并封口，保持培养基环境湿润，22℃恒温、全光照环境中预培养。4h后用授粉棒蘸取花粉，震动授粉棒使花粉均匀撒落到雌花的柱头上，可一边授粉，一边在解剖显微镜下对授粉情况进行观察。
[0017]预实验发现授粉24h后，花粉管可以生长到花柱底部，且自花授粉的花粉管已停止生长，因此授粉后再次培养24h让花粉萌发，花粉管生长。
[0018]所述的克服白桦自交不亲和性的试剂氯化二亚苯基碘的用法，步骤4)用苯胺蓝染色法来检测花粉管生长情况。
[0019]优选的，首先用FAA固定液将授粉24h的雌花进行固定。固定2h后，雌花样品用ddH2O清洗三次，注意不要破坏样品。再对雌花样品软化，使用1M NaOH溶液，60℃下软化1h。再次用ddH2O清洗三次。最后进行染色，加入配置好的0.1％苯胺蓝染色液，室温避光染色1
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2h或4℃过夜避光染色。染色后即可使用荧光显微镜观察花粉管。
[0020]克服白桦自交不亲和性的试剂在白桦自花授粉时花柱活性氧过高造成的自交不亲和性中的应用。
[0021]本专利技术的有益效果：
[0022]本实验方案打破了白桦自交不亲和性，有利于白桦保存其优良性状。本方案使用的克服白桦自交不亲和性的试剂，对植物无伤害性，且效果显著，易推广应用。同时建立的白桦雌花单花离体培养方法操作简单，有利于通过控制变量解析白桦授粉遇到的困难，同时使用的苯胺蓝检测法为观察白桦授粉提供了新的观察方法。
附图说明
[0023]图1为白桦雌花离体培养体系流程图；
[0024]图中：A.雌花序；B.单个雌花；C.预培养；D.授粉；E.再培养
[0025]图2为DPI处理后自花授粉图；
[0026]图中：明场用于观察雌花自然形态，蓝光用于观察花粉粒附着情况，紫外光用于观察花粉管生长情况；
[0027]图3为DPI处理后异花授粉图；
[0028]图中：明场用于观察雌花自然形态，蓝光用于观察花粉粒附着情况，紫外光用于观察花粉管生长情况；
[0029]图4为DPI处理花粉管长度统计图；
[0030]图中：****代表极显著性差异(P＜0.0001)，**代表显著性差异(P＜0.01)，ns代表非显著性差异(P＞0.05)。
具体实施方式
[0031]以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。
[0032]实施例1：
[0033]材料选用：挑选花序直立向本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种克服白桦自交不亲和性的试剂，其特征在于：所述试剂为混有氯化二亚苯基碘的二甲基亚砜溶液，该溶液混在PGM固体培养基中使用的终浓度为100μM
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500μM，最佳使用浓度为200μM，二甲基亚砜为溶剂。2.一种克服白桦自交不亲和性的试剂氯化二亚苯基碘的用法，其特征在于，步骤如下：1)配置的PGM固体培养基，包含DPI试剂的终浓度为100μM
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500μM；2)分离雌花，移植到步骤1配置的PGM固体培养基中进行培养；3)预培养4h后用授粉刷授粉，雌花再在PGM固体培养基中培养24h，让花粉管充分生长；4)使用苯胺蓝染色法来检测花粉管生长情况。3.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：蓝兴国，曹泽龙，孙梦平，张景雲，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：