一种基于埃洛石的脑部递送系统的制备工艺技术方案

本发明专利技术涉及埃洛石(HNTs)应用领域，且公开了一种基于埃洛石的脑部递送系统的制备工艺，其通过埃洛石与体外Aβ纤维(老年斑)共孵育，提供埃洛石在降解Aβ纤维(老年斑)的作用；对埃洛石进行短管化处理、氨基化修饰，再通过多功能PEG(NHS

【技术实现步骤摘要】
一种基于埃洛石的脑部递送系统的制备工艺


[0001]本专利技术属于埃洛石应用领域，具体为一种基于埃洛石的脑部递送系统的制备工艺。

技术介绍

[0002]关于阿尔茨海默病(AD)的发病机制和病因目前仍不清楚，β淀粉样蛋白(Aβ)级联假说是重要的AD发病机制：脑内Aβ聚集形成纤维(老年斑)沉淀，这个过程又会引发Tau蛋白聚集及异常磷酸化，神经纤维缠结等级联事件，进而引发神经炎症，并伴随着神经元的退化和死亡，导致AD患者的记忆和认知能力逐渐下降。
[0003]纳米材料能够清除与解聚Aβ纤维，其原因在于Aβ接触并吸附在纳米材料表面，从而与纳米材料发生相互作用，进而诱导蛋白质分子的构象变化，实现清除与解聚Aβ纤维的作用。
[0004]然而，纳米材料要穿过血脑屏障(BBB)，进入脑内才能发挥作用，BBB主要由脑毛细血管内皮、基膜和星形胶质细胞形成的胶质膜组成，保护大脑免受有害血源性物质和微生物的伤害，同时其抑制了98％的物质通过。

技术实现思路

[0005]要解决的技术问题：纳米材料难以很好的穿过血脑屏障进入脑内。
[0006]技术方案：本专利技术提供了一种基于埃洛石的脑部递送系统的制备工艺，包括埃洛石降解体外Aβ纤维、RVG29多肽修饰埃洛石的制备以及SH
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RVG/siRIPK1材料的制备，其中：埃洛石降解体外Aβ纤维是埃洛石与体外Aβ纤维共同孵育，埃洛石具有降解Aβ纤维的作用(备注：这个材料天然具有降解作用，不是通过共孵育才实现降解作用)；RVG29多肽修饰埃洛石的制备是对埃洛石进行短管化处理、氨基化修饰，再通过多功能PEG(NHS
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PEG
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MAL)将RVG29多肽连接到HNTs表面，NHS
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PEG
5000
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MAL中的NHS基团与埃洛石氨基化后的氨基反应形成稳定的酰胺键，MAL基团与RVG29多肽的巯基反应形成稳定的硫醚键；SH
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RVG/siRIPK1材料的制备是利用埃洛石管腔呈正电荷，负电荷siRNA通过静电作用直接装载于管内。
[0007]进一步地，埃洛石降解体外Aβ纤维包括以下步骤：步骤一、Aβ单体化处理，Aβ多肽溶于六氟异丙醇，水浴超声10min，将溶液按20μL/管分装到离心管中，通风橱中过夜，溶剂挥发后储存在
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80℃冰箱中备用；步骤二、Aβ纤维的制备，20μL的DMSO将Aβ单体溶解，PB(pH7.4，20mM)将其配制成30μM的Aβ溶液，于37℃培养箱中孵育6天得到成熟的Aβ纤维；步骤三、埃洛石与Aβ纤维共孵育，PB(pH7.4，20mM)配制1mg/mL的埃洛石溶液，并加入上述Aβ纤维中使其终浓度为100μg/mL，并以加入相同体积PB的Aβ纤维溶液为对照，于37℃培养箱中孵育3天；步骤四、降解观察，37℃、3天后的样品应用透射显微镜进行观察，样品各10μL滴加到230目的铜网中，2min后滤纸吸干铜网外围多余的液体，每个样品滴加20μL的2％磷钨酸溶液进行负染，30s后用200μL的DD水进行洗涤，滤纸吸干铜网外围多余的液体，晾干后在电镜下观察。
[0008]进一步地，RVG29多肽修饰埃洛石的制备包括以下步骤：步骤一、埃洛石的短管化，50mLDD水中加入1.5g聚乙烯吡咯烷酮和1.8g十六烷基三甲基溴化铵室温磁力搅拌均匀，随后加入1g埃洛石室温磁力搅拌10min；上述悬浮液于550w超声1.5h，3500转/分离心20min，收集上清，并用0.45μm滤膜过滤，收集滤液，于10000转/分离心10min，保留固体沉淀，并用无水乙醇和DD水交替洗涤6遍，冷冻干燥，得到短管化的埃洛石，平均粒径288nm；步骤二、表面氨基化，乙酸调节95％的乙醇溶液使其pH值到4.0，取上述溶液40mL加入5.6mL的3
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氨基丙基三乙氧基硅烷，混合均匀后，加入100mg短管化的埃洛石，400w超声5min，悬浮液转移到圆底烧瓶中，80℃冷凝回流12h，10000转/分离心10min，保留固体沉淀，并用无水乙醇和DD水交替洗涤6遍；步骤三、表面PEG修饰，氨基化后的短管化埃洛石转移到40mLPBS(0.2M，pH＝8.0)溶液中，400w超声5min，加入4mg多功能PEG(NHS
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PEG
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MAL)，室温搅拌3h，10000转/分离心10min，保留固体沉淀，并用DD水洗涤6遍；步骤四、RVG29多肽连接，PEG修饰后的固体分散于40mLPBS(1mM，pH＝7.4)溶液中，400w超声5min，加入5mgRVG29多肽，4℃下搅拌3.5h，10000转/分离心10min，保留固体沉淀，并用DD水洗涤6遍，冷冻干燥，得到SH
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RVG材料，SH
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RVG中RVG29的含量通过BCA方法进行测定。
[0009]进一步地，SH
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RVG/siRIPK1材料的制备包括以下步骤：步骤一、取6mg上述中的SH
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RVG，加入2mL生理盐水，400w超声5min，得到3mg/mL的SH
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RVG母液；步骤二、每管(1OD)siRIPK1加入DEPC水，配制成20μM溶液；步骤三、按照SH
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RVG与siRIPK1的质量比为50:1，将上述两种液体混合；步骤四、混合液真空环境下静置24h，DEPC水洗掉未结合的siRIPK1，12000转/分离心5min，收集固体沉淀，冷冻干燥，得到SH
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RVG/siRIPK1材料，SH
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RVG/siRIPK1中siRIPK1的装载量通过微量核酸蛋白检测仪进行测定。
[0010]技术效果：
[0011]本专利技术选择埃洛石制备递送系统兼具递送、靶向并降解Aβ纤维(老年斑)的双重作用；通过多功能PEG(NHS
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PEG
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MAL)将RVG29多肽连接到HNTs表面，制备出SH
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RVG纳米材料，RVG29多肽与BBB上受体结合，介导埃洛石载体穿透BBB；利用埃洛石管腔天然正电荷的特性，通过静电作用将siRNA吸附到埃洛石管腔内，防止siRNA降解，利用埃洛石可以与AD老年斑块结合，将siRIPK1递送到脑组织病变部位，从而起到降解Aβ老年斑和缓减神经元死亡等多靶点协同治疗AD的效果。
附图说明
[0012]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：
[0013]图1为本专利技术的埃洛石体外降解Aβ纤维的结果图；
[0014]图2为本专利技术的SH
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RVG的活体成像结果图；
[0015]图3为本专利技术的SH
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RVG体内降解Aβ老年斑块的结果图；
[0016]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于埃洛石的脑部递送系统的制备工艺，其特征在于，包括埃洛石降解体外Aβ纤维、RVG29多肽修饰埃洛石的制备以及SH
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RVG/siRIPK1材料的制备，其中：埃洛石降解体外Aβ纤维是埃洛石与体外Aβ纤维共同孵育，使得埃洛石具有降解Aβ纤维的作用；RVG29多肽修饰埃洛石的制备是对埃洛石进行短管化处理、氨基化修饰，再通过多功能PEG(NHS
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PEG
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MAL)将RVG29多肽连接到HNTs表面，NHS
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PEG
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MAL中的NHS基团与埃洛石氨基化后的氨基反应形成稳定的酰胺键，MAL基团与RVG29多肽的巯基反应形成稳定的硫醚键；SH
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RVG/siRIPK1材料的制备是利用埃洛石管腔呈正电荷，负电荷siRNA通过静电作用直接装载于管内。2.根据权利要求1所述的基于埃洛石的脑部递送系统的制备工艺，其特征在于，埃洛石降解体外Aβ纤维包括以下步骤：步骤一、Aβ单体化处理，Aβ多肽溶于六氟异丙醇，水浴超声10min，将溶液按20μL/管分装到离心管中，通风橱中过夜，溶剂挥发后储存在
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80℃冰箱中备用；步骤二、Aβ纤维的制备，20μL的DMSO将Aβ单体溶解，PB(pH7.4，20mM)将其配制成30μM的Aβ溶液，于37℃培养箱中孵育6天得到成熟的Aβ纤维；步骤三、埃洛石与Aβ纤维共孵育，PB(pH7.4，20mM)配制1mg/mL的埃洛石溶液，并加入上述Aβ纤维中使其终浓度为100μg/mL，并以加入相同体积PB的Aβ纤维溶液为对照，于37℃培养箱中孵育3天；步骤四、降解观察，37℃、3天后的样品应用透射显微镜进行观察，样品各10μL滴加到230目的铜网中，2min后滤纸吸干铜网外围多余的液体，每个样品滴加20μL的2％磷钨酸溶液进行负染，30s后用200μL的DD水进行洗涤，滤纸吸干铜网外围多余的液体，晾干后在电镜下观察。3.根据权利要求1所述的基于埃洛石的脑部递送系统的制备工艺，其特征在于，RVG29多肽修饰埃洛石的制备包括以下步骤：步骤一、埃洛石的短管化，50mLDD水中加入1.5g聚乙烯吡咯烷酮和1.8g十六烷基三甲基溴化铵室温磁力搅拌均匀，随后加入1g埃洛石室温磁力搅拌10min；上述悬浮液于550w超声1.5h，35...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴琳梅，杨世高，谭硕，闫怡竹，许俊男，
申请(专利权)人：安徽医科大学，
类型：发明
国别省市：