α-乙酰乳酸脱羧酶突变体及其在生产乙偶姻中的应用制造技术

本发明专利技术公开了α

【技术实现步骤摘要】
α
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乙酰乳酸脱羧酶突变体及其在生产乙偶姻中的应用


[0001]本专利技术属于生物工程领域，涉及α
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乙酰乳酸脱羧酶突变体及其在生产乙偶姻中的应用。

技术介绍

[0002]乙偶姻，又名3
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羟基
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丁酮，天然存在于许多食品中，被美国联邦应急管理署第2008号文件批准是一种公认的安全物质(GRAS)，主要用于食品行业来增强产品风味。乙偶姻也应用于医药、农业和化工行业。被美国能源部列为优先开发的30种平台化合物之一。化学合成法生产乙偶姻能耗大，成本高，对环境污染严重，所以生物法生产乙偶姻是未来的趋势。生物法合成乙偶姻的生产途径中，碳源通常进入糖酵解途径产生3
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磷酸甘油醛，然后生成丙酮酸，最后经过α
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乙酰乳酸合成酶和α
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乙酰乳酸脱羧酶催化的两步脱羧反应合成乙偶姻。
[0003]在乙偶姻的生物合成中，α
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乙酰乳酸脱羧酶催化的反应通常被认为是限速反应。两个丙酮酸分子在α
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乙酰乳酸合成酶的作用下聚合生成一分子α
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乙酰乳酸，而α
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乙酰乳酸是一种不稳定的物质，它可通过α
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乙酰乳酸脱羧酶的催化生成乙偶姻。在利用体外双酶级联反应进行乙偶姻的生产时，395.6g/L丙酮酸可快速生产186.7g/L乙偶姻，平均反应速率为15.56g/L/h。但在逐渐提高丙酮酸浓度的生产过程中，乙偶姻的得率越来越低r/>[1]，可能是由于α
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乙酰乳酸的不稳定性，也可能是反应过程中pH逐渐升高，使得ALDC的活性大大降低，所以通过蛋白质工程改造提高α
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乙酰乳酸脱羧酶的稳定性对乙偶姻的高效生产是有重大的意义的。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供α
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乙酰乳酸脱羧酶突变体。
[0005]本专利技术的第二个目的是提供α
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乙酰乳酸脱羧酶突变体的编码基因。
[0006]本专利技术的第三个目的是提供含上述α
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乙酰乳酸脱羧酶突变体的编码基因的工程菌。
[0007]本专利技术的第四个目的是提供上述α
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乙酰乳酸脱羧酶突变体在催化制备乙偶姻中的应用。
[0008]本专利技术的技术方案概述如下：
[0009]α
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乙酰乳酸脱羧酶突变体，所述α
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乙酰乳酸脱羧酶突变体为下列之一：SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的115位赖氨酸突变为甘氨酸，用SEQ ID No.3所示；SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的248位谷氨酸突变为丙氨酸和第167位天冬氨酸突变为丙氨酸，用SEQ ID No.5所示；SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的248位谷氨酸突变为丙氨酸、第115位赖氨酸突变为甘氨酸和第167位天冬氨酸突变为丙氨酸，用SEQ ID No.6所示；所述SEQ ID No.1所示的氨基酸序列为α
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乙酰乳酸脱羧酶的氨基酸序列。
[0010]上述α
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乙酰乳酸脱羧酶突变体的编码基因。
[0011]含上述α
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乙酰乳酸脱羧酶突变体的编码基因的工程菌。
[0012]上述α
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乙酰乳酸脱羧酶突变体催化制备乙偶姻中的应用。
[0013]有益效果
[0014]本专利技术的α
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乙酰乳酸脱羧酶突变体比野生型α
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乙酰乳酸脱羧酶的稳定性好，半衰期长，催化生产的乙偶姻产量高。
附图说明
[0015]图1为α
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乙酰乳酸脱羧酶表达载体示意图。
[0016]图2为α
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乙酰乳酸脱羧酶和α
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乙酰乳酸合成酶构建的双酶级联反应体系示意图。
[0017]图3为体外双酶级联反应体系生产乙偶姻(pH 7.0)。
具体实施方式
[0018]下面结合实施实例对本专利技术做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好的理解本专利技术，但对本专利技术不作任何限制。
[0019]原始质粒pET28a来源为biovector(http://www.biovector.net/)；
[0020]Escherichia coli BL21(DE3)感受态来源为NEB(http://www.neb
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china.com/)；
[0021]原始菌株Bacillus subtilis 168来源为BGSC(Bacillus Genetic Stock Center，http://www.bgsc.org/)；
[0022]所用限制性内切酶、去磷酸化酶、DNA连接酶等、分子生物学试剂从thermo公司购买(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)。
[0023]所有其他生化试剂(如胰蛋白胨、酵母抽提物、NaCl、TPP、MgCl2、ATP、NADP
+
等)从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)。
[0024]α
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乙酰乳酸脱羧酶的酶活测定：α
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乙酰乳酸脱羧酶催化α
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乙酰乳酸生成乙偶姻，其酶活的测定主要步骤如下：
[0025]首先制备α
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乙酰乳酸溶液，反应体系为80mM丙酮酸钠、10mM MgCl2、0.4mM TPP、2.0U/mLα
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乙酰乳酸合成酶和100mM磷酸缓冲液。配置好反应溶液，置于37℃摇床，220rpm反应20min，即可得到α
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乙酰乳酸溶液。将稀释至合适浓度的α
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乙酰乳酸脱羧酶粗酶液，取50μL加入等体积的α
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乙酰乳酸溶液混匀，在40℃温浴反应20min，取50μL上述反应液与200μL显色液(0.5％肌酸溶液和5％萘酚溶液按体积比1：1混合所得)混合，在37℃下温浴20min。在多功能微孔板检测仪中测定反应液在530nm处的吸光值。1U ALDC定义为1min内产成1μmol乙偶姻所需的酶量。
[0026]α
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乙酰乳酸脱羧酶的稳定性的测定：测定α
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乙酰乳酸脱羧酶突变体在40℃下放置不同时间后吸取相应量进行α
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乙酰乳酸脱羧酶的酶活测定。
[0027]酶的纯化具体步骤为：
[0028]1)将E.coli BL21(DE3)工程菌接种至含5mLLB液体培养基的试管中，在37℃摇床，220rpm培养12h。按1％的接种量加入至已添加50μg/mL卡那霉素的200mLLB液体培养基中，在37℃摇床，220rpm培养。待菌体OD<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.α
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乙酰乳酸脱羧酶突变体，其特征是所述α
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乙酰乳酸脱羧酶突变体为下列之一：SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的115位赖氨酸突变为甘氨酸，用SEQ ID No.3所示；SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的248位谷氨酸突变为丙氨酸和第167位天冬氨酸突变为丙氨酸，用SEQ IDNo.5所示；SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的248位谷氨酸突变为丙氨酸、第115位赖氨酸突变为甘...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈涛，崔真真，王智文，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：