一种具有咪唑啉酮类除草剂抗性的花生ALS突变基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及植物基因工程技术领域，提出了一种具有咪唑啉酮类除草剂抗性的花生ALS突变基因及其应用。所述花生抗咪唑啉酮类除草剂基因AhALS

【技术实现步骤摘要】
一种具有咪唑啉酮类除草剂抗性的花生ALS突变基因及其应用


[0001]本专利技术涉及植物基因工程
，具体的，涉及一种具有咪唑啉酮类除草剂抗性的花生ALS突变基因及其应用。

技术介绍

[0002]花生是我国重要的油料作物和经济作物，年均种植面积450万hm2，年均总产1600万t左右。长期以来，我国食用植物油供需矛盾突出，国内供给总量严重不足，进口风险剧增。与其他大宗油料作物相比，花生总产量大、单产水平高、单位面积产油量高、单位面积种植效益高，具有较大竞争优势，在保障我国食用油安全供给中发挥着不可替代的重要作用。然而，各种外界不利因素的影响已经成为花生生产发展的严重障碍，而花生田杂草因种类繁多、数量巨大、发生普遍，且与作物争水、肥、光等资源，改变田间小气候，甚至寄生多种病虫害，加速病虫害的蔓延，加之多数产区生长季节雨热同期，高温高湿更加重了草害，严重降低了花生的产量和品质，已成为花生机械化生产、轻简化栽培急需解决的关键问题。化学除草是控制农田杂草的经济有效手段。但是，由于常年施用单一除草剂，或除草剂成分类似，已造成抗药性杂草大量发生，加大了除草难度，加剧了杂草的危害。另一方面，花生田中既有马塘、稗草、牛筋草等禾本科杂草，更有反枝苋、马齿苋、铁苋菜等阔叶杂草，同时防除两种杂草涉及除草剂混用问题，由于除草剂具有高度选择性，稍有不慎即可对作物产生药害。此外，土壤中上茬作物除草剂残留物积累更可导致后茬作物的药害。众多研究指出，种植抗除草剂品种可以有效避免这些问题。目前，国内外研究者在水稻、玉米、小麦、棉花等粮食作物以及包括油菜、大豆、向日葵等在内的油源作物的耐除草剂基因发掘和种质创制方面已经取得了较大进展，国际上一些具有重要价值的转基因抗除草剂作物品种已经开始大规模商业化种植。但是，到目前为止，国内外还没有关于花生除草剂抗性基因的报道。
[0003]除草剂是通过干扰和抑制植物的代谢过程而造成杂草死亡，这些代谢过程往往由不同的酶系统所诱导。除草剂的作用靶标多是不同的酶系统，通过对靶标酶的抑制，最终干扰植物的代谢作用，如抑制植物光合作用、抑制细胞分裂、抑制脂肪或氨基酸生物合成等。不同类型除草剂可能抑制同一代谢反应，但是它们的作用位点(靶标酶)存在明显差异。咪唑啉酮类除草剂即是以支链氨基酸合成的起始酶乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)也称为乙酰羟基酸合成酶(acetohydroxyacid synthase，AHAS)为靶标开发的除草剂。除此之外，目前以ALS为靶标开发的除草剂还包括磺酰脲类(sulfonylureas，SU)、三唑嘧啶类(triazolopyrimidines，TP)、嘧啶水杨酸类(pyrimidyl
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benzoates，PB)和磺酰氨羧基三唑啉酮类(sulfonlyaminocarbonyl
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triazolinones，SCT)等5大类除草剂，统称为ALS抑制剂类除草剂。ALS抑制剂类除草剂通过抑制ALS酶的活性，导致支链氨基酸(包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)的合成受阻，蛋白质合成出现异常，最终导致植物生长停滞，继而死亡。ALS类除草剂具有选择性强、杀草谱广、除草效率高、使用剂量低、对人畜毒副作用低等优点，在生产上得到广泛应用，已成为继草甘膦后的第二大类除草剂。其中，咪唑啉
酮类除草剂又因其施用方便(既可土壤处理也可茎叶处理)、禾阔兼杀等诸多优点，而在花生等旱田作物广泛应用。但是，由于大量连续使用这类除草剂，使得抗该类除草剂的抗性杂草生物型数量急剧增加。
[0004]研究发现，绝大多数抗性杂草是由靶标基因位点突变产生的，这些位点存在于靶蛋白的多个不连续的保守功能域，这些功能域是ALS酶与不同除草剂结合的关键位点，突变后使得除草剂分子不能与突变ALS酶结合形成复合物或者其结合活性下降，但是突变体仍能正常合成支链氨基酸而正常生长，从而表现出基于靶标位点改变的ALS抗性。因为不同的除草剂与ALS酶的结合位点可能会有重合，因此关键位点突变可能导致两种或两种以上得除草剂抗性。拟南芥ALS基因研究表明，大多数抗性突变发生在Ala122、Pro197、Ala205、Trp574、Ser653等残基位点。
[0005]ALS酶是咪唑啉酮类等多种除草剂的共同作用靶标，国内外研究者已尝试利用多种策略利用ALS酶基因进行抗除草剂作物的培育，主要包括传统育种技术和现代生物技术。
[0006]传统育种技术主要是利用常规杂交育种方法，通过敏感型亲本与抗性亲本进行多次回交和轮回选择，将抗性亲本的基因导入杂交后代中，使优良基因逐代纯合、综合性状得以增强。但是，该方法仅能在杂交亲和的品种中才能成功，而花生中还未发掘出抗性种质资源，因此利用常规杂交育种技术培育抗除草剂新品种显得尤为困难。
[0007]现代生物技术为抗除草剂作物品种培育提供了有效的途径，目前主要有两种有效的方法被用于提高作物的抗药性。一是通过转基因技术将外源ALS突变基因导入目标作物中，但是不同作物来源的ALS突变序列对导入植株转基因的抗性存在差异；二是采用人工诱变的方法，又可以总结为三种途径，即化学诱变、基因组编辑以及PCR介导的体外定点突变，其原理都是基于改变ALS酶除草剂识别位点，即通过基因点突变的方法改变该酶蛋白的氨基酸序列，使除草剂无法识别ALS酶的位点，从而无法对作物发生作用。当然，这要保证酶的主要结构及功能不发生变化。EMS诱变创制抗除草剂作物虽然在某些作物上取得了成功，但其仍具有一定的局限性，如随机性太强，诱发突变的效率不高，产生的有益突变较少等，并不能实现真正意义上的定向诱变育种。以CRISPR/Cas9为代表的基因组编辑系统能通过RNA介导的Cas9酶切作用，在完整基因组上的特定位点完成切割反应，能实现对基因组进行高效、精确定点修饰(包括碱基突变、插入和缺失)，为培育抗除草剂作物带来新的曙光，然而对于属异源四倍体作物和具有庞大且复杂基因组的花生来说，该方法在遗传修饰和改良方面仍面临挑战。另一方面，在模式植物、作物以及杂草的系列研究中发现，抗ALS抑制剂类除草剂植物的抗性效应取决于ALS氨基酸突变的位置(不同的位点)、突变的氨基酸种类以及突变氨基酸的数量，而且不同遗传背景下相同位置的氨基酸变异产生的除草剂抗性效应也存在巨大差异。对于花生来说，具有除草剂抗性的突变体尚未获得，对抗性起决定作用的基因亦未明确，这已成为利用基因工程技术培育抗除草剂花生需要迫切解决的关键瓶颈问题。因此，创制具有育种利用价值的除草剂抗性基因对花生抗除草剂品种选育具有重要的意义。然而，目前尚未见花生抗ALS抑制剂类除草剂基因及其应用的报道。

技术实现思路

[0008]本专利技术提出一种具有咪唑啉酮类除草剂抗性的花生ALS突变基因及其应用，解决了相关技术中花生除草剂抗性基因和花生抗除草剂品种缺乏的难题，为培育优良的对咪唑
啉酮类除草剂高抗性的花生品种提供理论依据。
[0009]本专利技术的技术方案如下：
[0010]本专利技术提出了一种花生抗咪唑啉酮类除草剂基因AhALS
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种花生抗咪唑啉酮类除草剂基因AhALS
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G1709T，其特征在于，所述花生抗咪唑啉酮类除草剂基因AhALS
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G1709T的核苷酸序列为如下1)或2)：1)如SEQ ID NO3所示的核苷酸序列，由2001个碱基组成；2)如SEQ ID NO3所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的花生抗咪唑啉酮类除草剂基因AhALS
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G1709T，其特征在于，所述花生抗咪唑啉酮类除草剂基因AhALS
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G1709T由乙酰乳酸合成酶III编码基因AhALS进行体外定点突变修饰得到，所述乙酰乳酸合成酶III编码基因AhALS的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。3.根据权利要求2所述的花生抗咪唑啉酮类除草剂基因AhALS
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G1709T，其特征在于，所述乙酰乳酸合成酶III编码基因AhALS来源于花生，与其他来源的花生乙酰乳酸合成酶III的核酸序列相比，所述花生抗咪唑啉酮类除草剂基因AhALS
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G1709T第1709位碱基G变为T。4.根据权利要求3所述的花生抗咪唑啉酮类除草剂基因AhALS
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G1709T，其特征在于，所述乙酰乳酸合成酶III编码基因AhALS编码的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。5.如权利要求1
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4任意一项所述的花生抗咪唑啉酮类除草剂基因AhALS
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G1709T编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列为如下1)或2)：...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈四龙，许贤，王鸿梅，艾鹏飞，
申请(专利权)人：河北科技大学，
类型：发明
国别省市：