一种抗生素抗性基因检测试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术涉及一种抗生素抗性基因检测试剂盒，包括试剂盒盖、试剂盒体、八联管槽、阳性内控品槽、阳性内控品管、试剂反应管和阴性对照反应管，且所述试剂盒体的内开设有两个前后分布的所述八联管槽；本发明专利技术采用的探针法荧光定量检测法，并以细菌的16SrRNA的基因作为内参基因，本发明专利技术针对21个抗生素抗性基因设计了基因检测引物和荧光标记探针，分配到七个检测管中，每个管都有三种不同标记的抗生素抗性基因检测探针和对应引物，同时每个管都有内参基因的荧光检测探针和对应引物。本试剂盒适配能同时分辨FAM、VIC、ROX，CY5四种荧光信号的荧光定量PCR仪和数字PCR仪。本发明专利技术能提升检测通量，降低检测成本，具有更高的检测灵敏度和特异性。性。性。

【技术实现步骤摘要】
一种抗生素抗性基因检测试剂盒及其使用方法


[0001]本专利技术涉及病菌检测试剂盒领域，具体涉及一种抗生素抗性基因检测试剂盒及其使用方法。

技术介绍

[0002]自20世纪20年代开始，大量天然抗生素包括青霉素、链霉素等相继被发现，由此人类开启了抗生素时代，在与细菌的对抗中占有绝对优势。但随着对抗生素使用的过度依赖，抗生素抗性基因(Antibiotics resistance genes,ARGs)不断出现并在环境微生物中大量累积，导致微生物耐药性问题越来越严重。ARGs在微生物之间的水平和垂直转移，使得一代代抗生素药物威力减弱、甚至失效。抗生素抗性基因作为一种新的环境污染物，影响了生物安全，并严重威胁到人类健康。
[0003]因此，对ARGs进行快速鉴定并定量，是监测环境微生物耐药性或对人和动物微生物感染耐药性进行评估的有效手段，对监测ARGs污染和指导人畜抗生素使用具有重要作用。
[0004]研究人员经过大量文献调研和环境微生物抗生素抗性基因检测工作，发现了有21种抗生素抗性基因检出率较高，且这21个基因与微生物耐药的关联性较明确，这21个抗生素抗性基因分别是tetG1、tetW、tnpA
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2(耐四环素类)、sul1、sul2(耐磺胺类)、blaTEM
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1、ampc(耐β
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内酰胺类)、ermX(耐MLSB类)、acrB(耐替加环素类)、aac(6')
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lb
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cr、aadA
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01、strA(耐氨基糖苷类)、VanTC
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02、vanXO(耐万古霉素类)、MexE、qac(多重耐药类)、intI
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1、ISCR1(移动转移元器件)、cmlA1、cmlB(耐氯霉素类)、floR(耐氟氯霉素)。
[0005]目前一般采用染料法荧光定量PCR进行检测，检测时往往将检测样本转移到实验室，实验室常规检测仪器体积较大，移动不便，样本需要在运输过程中保持低温，容易发生生物安全泄漏，样本保存不当发生变化的风险。染料法荧光定量PCR由于本身特异性不高，导致容易检出假阳性，导致结果准确率不高，且一个反应孔只能检测一个样本的一个靶标基因，而本方案一个孔可以检测三个靶标基因，通量提升了三倍，检测综合成本更低。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种低成本、高通量、高灵敏度、高特异性以及安全便捷的病菌抗生素抗性基因检测试剂盒。
[0007]具体的，本专利技术提供了一种抗生素抗性基因检测试剂盒。
[0008]包括试剂盒盖、试剂盒体、八联管槽、阳性内控品槽、阳性内控品管、试剂反应管和阴性对照反应管，所述试剂盒体的顶部后方活动连接有所述试剂盒盖，且所述试剂盒体的内部开设有两个前后分布的所述八联管槽，每个所述八联管槽的内部均设有七个从左到右依次排布的所述试剂反应管和位于一端的单个所述阴性对照反应管，所述试剂盒体的内部一侧开设有所述阳性内控品槽，所述阳性内控品槽的内部设有所述阳性内控品管。
[0009]优选的，所述阳性内控品管预先加入阳性内控品用于对照，所述阳性内控品是多
种合成的已知基因序列的DNA片段。
[0010]优选的，所述阳性内控品包括抗生素抗性基因阳性内控品和内参基因阳性内控品。
[0011]优选的，阳性内控品管中预先加入的每种阳性内控品DNA片段的终浓度为106Copy/μL。
[0012]优选的，所述抗生素抗性基因阳性内控品对应的核苷酸序列为SEQ IDNO.1
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SEQ ID NO.21。
[0013]优选的，所述抗生素抗性基因包括tetG1、tetW、tnpA
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2、sul1、sul2、blaTEM
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1、ampc、ermX、acrB、aac(6')
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lb
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cr、aadA
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01、strA、VanTC
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02、vanXO、MexE、qac、intI
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1、ISCR1、cmlA1、cmlB、floR。
[0014]优选的，所述试剂盒的基因检测方法为探针法荧光定量PCR或探针法数字PCR。
[0015]优选的，每一个试剂反应管中预先加入三种不相互干扰的靶标抗性基因检测探针以及对应的三种靶标抗性基因检测引物，每种靶标抗性基因检测探针的5'端分别连接不同的荧光染料(FAM/VIC/ROX)标记的荧光报告基团，每种探针的3'端连接BHQ1荧光淬灭基团，阴性对照反应管预先加入所有靶标抗性基因检测探针以及对应的靶标抗性基因检测引物。
[0016]优选的，每个试剂反应管中预先加入的靶标抗性基因检测探针的序列、对应的靶标抗性基因检测引物的序列、以及对应的靶标抗性基因检测用探针连接的荧光基团选自下表所示的组合：
[0017][0018][0019]优选的，七个试剂反应管中每管的加入的三种靶标抗性基因检测探针和靶标抗性基因检测引物对应的抗性基因的组合为：tetG1、tetW、tnpA
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2一管，sul1、sul2、blaTEM
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1一管，ampc、ermX、acrB一管，aac(6')
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lb
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cr、aadA
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01、strA一管，VanTC
‑
02、vanXO、MexE一管，qac、intI
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1、ISCR1一管，cmlA1、cmlB、floR一管。
[0020]优选的，每个所述试剂反应管和阴性对照反应管中预先加入的每种靶标抗性基因检测引物终浓度为0.8μmol/L，每种靶标抗性基因检测探针终浓度为0.3μmol/L，
[0021]优选的，所述试剂盒使用内参基因进行对照检测。
[0022]优选的，所述内参基因为微生物16S rRNA的基因。
[0023]优选的，每一个试剂反应管和阴性对照反应管中预先加入内参基因检测引物和内参基因检测探针，阳性内控品管中预先加入等物质量混合的内参基因阳性内控品，内参基因检测探针的5'端连接荧光报告基团(CY5)，3'端连接用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团(BHQ1)。
[0024]优选的，所述内参基因检测引物的序列、内参基因检测探针的序列、内参基因阳性内控品的序列以及内参基因检测探针连接的荧光基团如下表所示：
[0025][0026]优选的，所述试剂反应管、阴性对照反应管和阳性内控品管中预先加入含有PCR酶的反应预混液。
[0027]优选的，包括以下步骤：将检测合格的微生物DNA各取2μL加入到八联管的前七个试剂反应管中，阴性对照反应管不加任何样本或2μL试剂级无核酸水；加好样本后，在包括FAM、VIC、ROX、CY5四色荧光通道的16孔便携式荧光定量PCR仪上进行扩增反应，采集FAM、VIC、ROX、CY5荧光通道信号，当本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗生素抗性基因检测试剂盒，其特征在于，包括试剂盒盖(1)、试剂盒体(2)、八联管槽(3)、阳性内控品槽(4)、阳性内控品管(5)、试剂反应管(6)和阴性对照反应管(7)，所述试剂盒体(2)的顶部后方活动连接有所述试剂盒盖(1)，且所述试剂盒体(2)的内部开设有两个前后分布的所述八联管槽(3)，每个所述八联管槽(3)的内部均设有七个从左到右依次排布的所述试剂反应管(6)和位于一端的单个所述阴性对照反应管(7)，所述试剂盒体(2)的内部一侧开设有所述阳性内控品槽(4)，所述阳性内控品槽(4)的内部设有所述阳性内控品管(5)。2.根据权利要求1所述的一种抗生素抗性基因检测试剂盒，其特征在于：所述阳性内控品管(5)预先加入阳性内控品用于对照，所述阳性内控品是多种合成的已知基因序列的DNA片段。3.根据权利要求2所述的一种抗生素抗性基因检测试剂盒，其特征在于：所述阳性内控品包括抗生素抗性基因阳性内控品和内参基因阳性内控品。4.根据权利要求2所述的一种抗生素抗性基因检测试剂盒，其特征在于，阳性内控品管(5)中预先加入的每种阳性内控品DNA片段的终浓度为106Copy/μL。5.根据权利要求3所述的一种抗生素抗性基因检测试剂盒，其特征在于，所述抗生素抗性基因阳性内控品对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.1
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SEQ IDNO.21。6.根据权利要求1所述的一种抗生素抗性基因检测试剂盒，其特征在于，所述抗生素抗性基因包括tetG1、tetW、tnpA
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2、sul1、sul2、blaTEM
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1、ampc、ermX、acrB、aac(6')
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lb
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cr、aadA
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01、strA、VanTC
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02、vanXO、MexE、qac、intI
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1、ISCR1、cmlA1、cmlB、floR。7.根据权利要求1所述的一种抗生素抗性基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的基因检测方法为探针法荧光定量PCR或探针法数字PCR。8.根据权利要求1所述的一种抗生素抗性基因检测试剂盒，其特征在于，每一个试剂反应管(6)中预先加入三种不相互干扰的靶标抗性基因检测探针以及对应的三种靶标抗性基因检测引物，每种靶标抗性基因检测探针的5'端分别连接不同的荧光染料(FAM/VIC/ROX)标记的荧光报告基团，每种探针的3'端连接BHQ1荧光淬灭基团，阴性对照反应管(7)预先加入所有靶标抗性基因检测探针以及对应的靶标抗性基因检测引物。9.根据权利要求7所述的一种抗生素抗性基因检测试剂盒，其特征在于，每个试剂反应管(6)中预先加入的靶标抗性基因检测探针的序列、对应的靶标抗性基因检测引物的序列、以及对应的靶标抗性基因检测用探针连接的荧光基团选自下表所示的组合：
10.根据权利要求8所述的一种抗生素抗性基因检测试剂盒，其特征在于，七个试剂反应管(6)中每管的加入的三种靶标抗性基因检测探针和靶标抗性基因检测引物对应的抗性基因的组合为：tetG1、tetW、tnpA

【专利技术属性】
技术研发人员：张鸿，朱国萍，高轩，刘晓蕙，徐文强，文斌，卞命杰，陈雪霏，胡德港，龚羽，唐亚伟，李西清，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：