使用微芯片毛细管电泳对腺相关病毒的表征制造技术

提供了用于鉴定含有病毒载体的样品中衣壳病毒蛋白的方法和系统，包括确定腺相关病毒的衣壳病毒蛋白的比例。所述方法和系统包含将所述样品中的所述衣壳病毒蛋白变性、用赖氨酸偶联物染料标记变性的衣壳病毒蛋白、使用微芯片毛细管电泳生成变性/标记的衣壳病毒蛋白的分离谱、基于所述分离谱定量所述衣壳病毒蛋白的水平、基于所述分离谱确定所述衣壳病毒蛋白的定量比以及基于所述衣壳病毒蛋白的赖氨酸含量对所述定量比进行归一化。含量对所述定量比进行归一化。含量对所述定量比进行归一化。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用微芯片毛细管电泳对腺相关病毒的表征
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年8月28日提交的美国临时专利申请第63/071,815号的优先权和权益，其通过引用并于此。


[0003]本专利技术大体上涉及使用微芯片毛细管电泳结合荧光染料表征或定量腺相关病毒衣壳蛋白的方法和系统。

技术介绍

[0004]基因治疗生物药物通过转录和/或翻译转移的遗传物质(例如将遗传物质整合到宿主基因组中)来调节治疗效果。基因治疗生物药物包括核酸、质粒、病毒、载体或基因工程微生物。腺相关病毒(AAV)已被广泛用作基因递送载体来递送用于基因治疗的遗传物质。尽管AAV不整合到宿主基因组中，但AAV可在非分裂细胞中提供长期基因表达。
[0005]在生物药物产品的制造过程中，产品评价包括评定制造中使用的成分、检验/表征最终产品以及评价制造过程的控制，以确保产品的安全性和质量。应当对最终产物的纯度、一致性和效力进行检验和表征。因此，针对AAV的产品检验可以包括检验感染性与非感染性载体的比例、空衣壳的存在或者病毒蛋白的化学计量比例。表征AAV衣壳蛋白对于确保AAV的产品质量和批次间的一致性至关重要，因为AAV病毒衣壳蛋白的装配对AAV的感染性、效力和稳定性具有重要影响。
[0006]应当理解，需要用于鉴定和表征AAV的衣壳病毒蛋白的方法和系统。AAV的衣壳病毒蛋白的表征应当包括确定不同衣壳病毒蛋白的比例，因为衣壳病毒蛋白的正确比例对于AAV的生物学功能(具体地，衣壳结构以及介导组织嗜性的氨基酸差异)至关重要。这些方法和系统应该提供对AAV衣壳病毒蛋白的稳健、快速、可靠、灵敏且高通量的检测和表征。

技术实现思路

[0007]本申请提供用于鉴定和/或表征含有病毒载体的样品中衣壳病毒蛋白的方法和系统。这些方法和系统提供快速、可靠、灵敏且高通量的方法来鉴定衣壳病毒蛋白，包括确定AAV的不同衣壳病毒蛋白的比例。
[0008]本公开提供一种确定含有病毒载体的样品中两种或更多种蛋白质之间的定量比的方法。在一些示例性实施例中，本公开提供了一种方法，其包含：将样品中的两种或更多种蛋白质在变性溶液中在至少大约60℃的温度下变性；用赖氨酸偶联物染料(lysine
‑
conjugation dye)标记变性的两种或更多种蛋白质；使用微芯片毛细管电泳生成变性/标记的两种或更多种蛋白质的分离谱；基于分离谱定量两种或更多种蛋白质的水平；以及将定量的两种或更多种蛋白质的水平进行比较以确定所述两种或更多种蛋白质之间的定量比。
[0009]在一方面，本申请的方法进一步包含基于两种或更多种蛋白质的赖氨酸含量对定
量比进行归一化。在一方面，本申请的方法进一步包含基于分离谱的迁移时间对定量比进行校正。在一方面，本申请的方法中的赖氨酸偶联物染料是胺反应性荧光染料。在另一方面，本申请的方法中的赖氨酸偶联物染料包含活性酯、异硫氰酸酯或磺酰氯。在又一方面，本申请的方法中的赖氨酸偶联物染料包含活性酯，其中该活性酯包括琥珀酰亚胺酯、磺基琥珀酰亚胺酯、四氟苯基酯或磺基二氯苯酚酯。
[0010]在一方面，本申请的方法中的病毒载体是AAV。在一方面，本申请的方法中的病毒载体包含病毒蛋白1(VP1)、病毒蛋白2(VP2)和病毒蛋白3(VP3)。在另一方面，本申请的方法中的变性溶液包含洗涤剂，其中该洗涤剂是十二烷基硫酸锂(LDS)或十二烷基硫酸钠(SDS)。
[0011]本公开至少部分地提供了用于确定含有至少一种病毒载体的样品中两种或更多种蛋白质之间的定量比的系统。在一些示例性实施例中，本公开提供了一种系统，其包含：微板，用于接收含有至少一种病毒载体的样品、能够在至少大约60℃的温度下将所述样品中的两种或更多种蛋白质变性的变性溶液以及能够对所述两种或更多种蛋白质进行标记的赖氨酸偶联物染料；以及微芯片毛细管电泳装置，其能够接收微板、分离变性/标记的两种或更多种蛋白质以生成分离谱、定量两种或更多种蛋白质的水平以及将定量的两种或更多种蛋白质的水平进行比较以确定两种或更多种蛋白质之间的定量比。
[0012]在一方面，可以基于两种或更多种蛋白质的赖氨酸含量对定量比进行归一化。在一方面，可以基于分离谱的迁移时间对定量比进行校正。在另一方面，本申请的系统中的赖氨酸偶联物染料是胺反应性荧光染料。在一方面，本申请的系统中的赖氨酸偶联物染料包含活性酯、异硫氰酸酯或磺酰氯。在又一方面，本申请的系统中的赖氨酸偶联物染料包含活性酯，其中该活性酯包括琥珀酰亚胺酯、磺基琥珀酰亚胺酯、四氟苯基酯或磺基二氯苯酚酯。
[0013]在一方面，本申请的系统中的病毒载体是AAV。在一方面，本申请的系统中的病毒载体包含VP1、VP2和VP3。在另一方面，本申请的系统中的变性溶液包含洗涤剂，其中所洗涤剂是LDS或SDS。
[0014]当结合以下描述和附图进行考虑时，将更好地理解和明白本专利技术的这些和其它方面。以下描述虽然表明了各种实施例及其许多具体细节，但是是以说明而非限制的方式给出的。在本专利技术的范围内可以进行许多替换、修改、添加或重新排列。
附图说明
[0015]图1示出了根据Venkatakrishnan等人的腺相关病毒1型VP1独特N端结构域的结构和动力学及其在衣壳运输中的作用(Structure and Dynamics of Adeno
‑
Associated Virus Serotype 1VP1
‑
Unique N
‑
Terminal Domain and Its Role in Capsid Trafficking)《病毒学杂志(Journal of Virology)》,2013年5月,第87卷第9期,第4974至4984页，的AAV1的结构，包括AAV1衣壳VP3单体的晶体结构和AAV1衣壳的表面表示。
[0016]图2示出了根据Jin等人的完全表征重组腺相关病毒衣壳蛋白的直接液相色谱/质谱分析(Direct liquid chromatography/mass spectrometry analysis for complete characterization of recombinant adeno
‑
associated virus capsid proteins)《人类基因治疗方法(Human gene therapy methods)》,2017年,第28卷第5期,第255至267页，使
用常规方法如SDS
‑
PAGE和反相液相色谱进行的AAV衣壳病毒蛋白分离。
[0017]图3示出了根据示例性实施例在还原性条件下用赖氨酸偶联物染料标记蛋白质的样品制备方法。
[0018]图4示出了根据示例性实施例在非还原性条件下用赖氨酸偶联物染料标记蛋白质的样品制备方法。
[0019]图5示出了根据示例性实施例的含有分子量为15.9kDa(LA1)、20.4kDa(LA2)、28.9k本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种确定含有至少一种病毒载体的样品中两种或更多种蛋白质之间的定量比的方法，其包含：(a)将所述样品中的所述两种或更多种蛋白质在变性溶液中在至少大约60℃的温度下变性；(b)用赖氨酸偶联物染料标记变性的两种或更多种蛋白质；(c)使用微芯片毛细管电泳生成标记的两种或更多种蛋白质的分离谱；(d)基于所述分离谱定量所述两种或更多种蛋白质的水平；以及(e)将定量的所述两种或更多种蛋白质的水平进行比较以确定所述两种或更多种蛋白质之间的定量比。2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含基于所述两种或更多种蛋白质的赖氨酸含量对所述定量比进行归一化。3.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含基于所述分离谱的迁移时间对所述定量比进行校正。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述赖氨酸偶联物染料是胺反应性荧光染料。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述赖氨酸偶联物染料包含活性酯、异硫氰酸酯或磺酰氯。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述赖氨酸偶联物染料包含活性酯，其中所述活性酯包括琥珀酰亚胺酯、磺基琥珀酰亚胺酯、四氟苯基酯或磺基二氯苯酚酯。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种病毒载体是腺相关病毒。8.根据权利要求所述1的方法，其中所述至少一种病毒载体包含病毒蛋白1(VP1)、病毒蛋白2(VP2)和病毒蛋白3(VP3)。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述变性溶液包含洗涤剂。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述变性溶液包含十二...

【专利技术属性】
技术研发人员：B，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：