番茄SlERF.H6基因在调控茄碱代谢降低番茄毒性中的应用制造技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域。具体涉及番茄SlERF.H6基因调控茄碱代谢通路基因并降低植株毒性方面的应用。通过正向遗传学手段，采用全基因组关联分析(mGWAS)的方法，定位到番茄SlERF.H6基因，并通过在番茄植株中进行超量表达和CRISPR编辑表达，发现超量表达SlERF.H6基因可以降低番茄中毒性番茄甾体糖苷生物碱代谢物含量，使无毒性的生物碱代谢物含量上升，证实了该基因的生物学功能及应用途径。径。径。

【技术实现步骤摘要】
Phytologist.2022,233:1220
‑
1237)。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的涉及一个调控番茄中SlGAMEs的表达以降低番茄毒性的乙烯响应转录因子SlERF.H6的应用。
[0005]本专利技术的技术方案为：分离的番茄SlERF.H6基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0006]一种表达载体，表达SEQ ID No.2所示的蛋白，进一步地，该表达载体含有SEQ IDNo.1所示的番茄SlERF.H6基因。
[0007]上述所述的番茄SlERF.H6基因或上述所述的表达载体在调控番茄中对人体具有毒性的甾体生物碱及其糖基化的修饰物含量上的应用。
[0008]进一步地，通过转基因使番茄SlERF.H6基因在番茄中超量表达，从而降低番茄中对人体具有毒性的甾体生物碱及其糖基化的修饰物含量。
[0009]进一步地，所述对人体具有毒性的甾体生物碱及其糖基化的修饰物是指α
‑
番茄碱(α
‑
tomatine)。
[0010]通过正向遗传学手段，采用全基因组关联分析(mGWAS)的方法，定位到番茄SlERF.H6基因，并通过在番茄植株中进行超量表达和CRISPR编辑表达，发现超量表达SlERF.H6基因可以降低番茄中毒性番茄甾体生物碱代谢物含量，无毒性的生物碱代谢物含量上升，证实了该基因的功能及应用途径。
[0011]与现有技术相比，本专利技术具有以下效果：
[0012]通过转基因材料检测进一步验证了SlERF.H6在调控SGAs合成及分解方面的作用，这能够为番茄育种过程中促进植株发育和降低毒性方面提供重要的参考依据，对于培育高品质的番茄新品种将具有重要的指导意义。
[0013]下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。
附图说明
[0014]图1：通过mGWAS筛选定位到SlERF.H6基因，图1中的A图为糖苷甾体生物碱(Dihydroxy tomatidine
‑
O
‑
hexosyl
‑
O
‑
rhamnoside)含量的全基因组关联分析结果，虚线表示显著性阈值(P＝5.39E
‑9)；图1中的B图和C图为定位到的基因所在的3号染色体区域的连锁不平衡(LD)分析。
[0015]图2：SlERF.H6基因在番茄不同发育时期的表达量及在植物激素处理下表达量变化，图2中A图为SlERF.H6基因在番茄不同发育时期的表达量；图2中B为SlERF.H6基因在ACC和GA3处理后4、8、12、24小时的表达量；NL表示新叶，ML表示成熟的叶，R表示根，S表示茎，IF表示未成熟的花，MF表示成熟的花，F1表示直径为1cm的果实、F2直径为2cm的果实、IGF表示未成熟青果，MG表示成熟绿果，BR表示破色期；BR3、7、10表示破色后天数。RF表示红果。结果基于三次重复，误差线代表标准偏差(SD)，**表示Pvalue值小于0.01，***表示P value值小于0.001，****表示P value值小于0.0001，三者均表示差异极显著。
[0016]图3：SlERF.H6基因转基因材料的构建及鉴定，图中A为SlERF.H6基因超表达植株表达量检测；图中B为SlERF.H6基因的结构预测；图中C为SlERF.H6基因敲除材料鉴定结果。
结果基于三次重复，误差线代表标准偏差(SD)，**表示P value值小于0.01，***表示P value值小于0.001，****表示P value值小于0.0001，三者均表示差异极显著。
[0017]图4：SlERF.H6基因超表达植株中甾体生物碱合成通路相关基因表达量和物质含量，虚线表示其中有步骤省略，实线表示只有一步。结果基于三次重复，误差线代表标准偏差(SD)，**表示P value值小于0.01，***表示P value值小于0.001，****表示P value值小于0.0001，三者均表示差异极显著。
[0018]图5：SlERF.H6基因可以直接结合甾体生物碱合成通路已报道SlGAMEs基因的启动子。图中A为转录因子SlERF.H6与GAME系列基因的酵母单杂结果；图中B为转录因子SlERF.H6和GAME系列基因的荧光素酶互补(Luciferase assay,LUC)系统示意图；图中C为图中B的实验结果；图中D为转录因子SlERF.H6与GAME系列基因互作的凝胶迁移(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)结果。结果基于三次重复，误差线代表标准偏差(SD)，**表示P value值小于0.01，***表示P value值小于0.001，****表示P value值小于0.0001，三者均表示差异极显著。
[0019]图6：SlERF.H6基因受SlGAME9负调控。图中A为转录因子SlERF.H6的启动子序列分析；图中B为转录因子SlERF.H6与GAME9的酵母单杂结果；图中C为转录因子SlERF.H6与GAME9互作的凝胶迁移(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)结果；图中D为转录因子SlERF.H6和GAME9基因的荧光素酶互补(Luciferase assay,LUC)系统示意图；图中E为图中D的实验结果。结果基于三次重复，误差线代表标准偏差(SD)，**表示Pvalue值小于0.01，***表示P value值小于0.001，****表示P value值小于0.0001，三者均表示差异极显著。
[0020]图7：入门载体pDonr207质粒图谱。
[0021]图8：超量表达载体pBI121质粒图谱。
[0022]图9：CRISPR编辑载体pTX41质粒图谱。
具体实施方式
[0023]以下实施例定义了本专利技术，并描述了本专利技术在分离克隆包含有SlERF.H6基因完整编码区段的DNA片段，以及验证SlERF.H6基因功能的方法。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
[0024]所用试剂和培养基的配制：
[0025](1)试剂和溶液缩写：本专利技术中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下，KN(Kanamycin，卡那霉素)；KT(Kinetin，激动素)；IAA(Indole
‑3‑
acetic acid，吲哚乙酸)；2,4
‑
D(2,4
‑
Dichlorophenoxyacetic acid，2,4
‑
二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；Tim(Timentin，特美汀)；ZR(trans
‑
Zeatin
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.分离的番茄SlERF.H6基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.一种表达载体，其特征在于，表达SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白。3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，含有权利要求1所述的番茄SlERF.H6基因。4.权利要求1所述的番茄SlERF.H6基因或权利要求2或3所述的表达载体在调控番茄甾体生物...

【专利技术属性】
技术研发人员：王守创，郝英辰，向丽君，杨君，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：