一种体外快速合成环状DNA的方法技术

本发明专利技术提出了一种体外快速合成环状DNA的方法，属于基因工程技术领域。包括：S1.以基因组为模板，针对所需合成环状DNA对应的线性DNA片段分别设计正向引物和反向引物进行PCR，产生线性DNA

【技术实现步骤摘要】
一种体外快速合成环状DNA的方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种体外快速合成环状DNA的方法。

技术介绍

[0002]染色体外环状DNA(Extrachromosomal circμLar DNA,eccDNA)是真核生物中一类特殊的环状DNA，最早的报道见于1965年，是部分基因组DNA在一定条件下从染色体上脱落，通过一系列复杂机制成环，形成的环状DNA，其大小从100bp到数百万bp不等,可来源于基因组的不同位点。EccDNA能通过多种途径在生理及病理过程中发挥重要的作用，一些研究认为许多重要的原癌基因主要以eccDNA为载体进行扩增,表明它与肿瘤细胞癌基因拷贝数增加和基因转录水平提高相关，同时与肿瘤的异质性，转移，耐药以及不良预后相关。然而，单个eccDNAs的功能在很大程度上是未知的。主要问题之一是缺乏有效和稳定的方法来在体外合成单个eccDNA用于下游测定以探索其功能。
[0003]目前，体外合成eccDNA可以通过使用Taq DNA连接酶(参考文献：Du,Q.,Kotlyar,A.and Vologodskii,A.(2008)Kinking the double helix by bending deformation.NUCLEICACIDSRES,36,1120
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1128.)和T4 DNA连接酶(参考文献：Kuhn,H.and Frank Kamenetskii,M.D.(2005)Template
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independent ligation of single
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stranded DNAby T4 DNAligase.TheFEBSjournal,272,5991
‑
6000.)等方法合成。长度为84～106bp的小环可通过Taq DNA连接酶合成。这种方法受DNA长度的限制，而合成长链DNA(>100bp)的价格昂贵。后来，引入了一种非模板连接方法，通过T4 DNA连接酶将HindⅢ粘性末端的DNA自连接成环，这种连接反应需要0.1
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10nm范围内的非常低的DNA浓度来抑制分子间连接，因此产量非常低。Henrik Devitt et al.最近研究表明(参考文献：H.D.,Lin,L.,Xiang,X.,Petersen,T.S.,Huang,J.,Yang,L.,Kjeldsen,E.,Jensen,U.B.,Zhang,X.and Liu,X.et al..(2018)CRISPR
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C:circμLarization of genes and chromosome by CRISPR in human cells.NUCLEICACIDSRES.)，CRISPR
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C可以从基因间和基因位点生成eccDNA，大小范围从几百个碱基对到207kb不等，但这种方法需要一个特定的基因编辑系统，耗时且复杂。是否能深入研究特定序列eccDNA的功能，迫切需要开发一种快速、稳定的方法来合成长度范围广的eccDNAs。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提出一种体外快速合成环状DNA的方法，通过PCR方法提供一种体外简单快速合成eccDNA的方法。该方法成功的解决了以往合成eccDNA的长度限制以及浓度限制的两大关键问题，为eccDNA的分子机制研究提供了可能方案。
[0005]本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0006]本专利技术提供一种体外快速合成环状DNA的方法，包括以下步骤：
[0007]S1.以基因组为模板，针对所需合成环状DNA对应的线性DNA片段分别设计正向引物和反向引物进行PCR，产生线性DNA
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A片段；
[0008]S2.以步骤S1制得的DNA
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A片段为模板，分别设计引物产生1/2A片段，分别为DNA
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C片段和DNA
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D片段；
[0009]S3.将步骤S2制得的1/2A片段进行梯度退火，产生黏性DNA
‑
C片段和DNA
‑
D片段；
[0010]S4.用T7连接酶连接步骤S3制得的黏性DNA
‑
C片段和DNA
‑
D片段；
[0011]S5.以步骤S4制得的DNA片段为模板，再进行PCR，产生DNA
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E片段；
[0012]S6.将DNA
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A片段和DNA
‑
E片段经过Taq DNALigase试剂进行成环反应，制得环状DNA。
[0013]作为本专利技术的进一步改进，设计1/2A片段的引物设计为互补结构。
[0014]作为本专利技术的进一步改进，步骤S1中所述PCR体系如下：2*PCR缓冲液for KODFX 20
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30μL，2mMdNTPs 8
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12μL，F
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Primer 1
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2μL，R
‑
Primer 1
‑
2μL，Genomic DNA 180
‑
220ng，KODFX 0.5
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1.5μL，ddH2O加至50μL。
[0015]作为本专利技术的进一步改进，步骤S1中所述PCR反应条件为：90
‑
96℃，2min；95
‑
100℃，10s，50
‑
60℃，30s，65
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75℃，3min，30循环；3
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5℃，∞。
[0016]作为本专利技术的进一步改进，步骤S2和步骤S4的反应体系和反应条件与步骤S1相同。
[0017]作为本专利技术的进一步改进，步骤S3的反应体系如下：DNA
‑
C片段20μL，DNA
‑
C
’
片段20μL，5*DNAAnnealing缓冲液10μL，总计50μL。
[0018]作为本专利技术的进一步改进，步骤S3的反应条件如下：90
‑
100℃，3min；85
‑
95℃，3min；80
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90℃，3min，以每下降5℃维持3min，梯度降温至25℃。
[0019]作为本专利技术的进一步改进，步骤S4的反应体系如下：DNALigase Reaction缓冲液10μL，黏性DNA
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C片段5μL，黏性DNA
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D片段5μL，DNAliagse1μL，总计21μL；反应条件：25℃，30min
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1h，失活：65℃，20min。
[0020]作为本专利技术的进一步改进，步骤S6的反应体系如下：DNA
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A片段400
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600ng，DNA
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E片段400
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外快速合成环状DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.以基因组为模板，针对所需合成环状DNA对应的线性DNA片段分别设计正向引物和反向引物进行PCR，产生线性DNA
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A片段；S2.以步骤S1制得的DNA
‑
A片段为模板，分别设计引物产生1/2A片段，分别为DNA
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C片段和DNA
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D片段；S3.将步骤S2制得的1/2A片段进行梯度退火，产生黏性DNA
‑
C片段和DNA
‑
D片段；S4.用T7连接酶连接步骤S3制得的黏性DNA
‑
C片段和DNA
‑
D片段；S5.以步骤S4制得的DNA片段为模板，再进行PCR，产生DNA
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E片段；S6.将DNA
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A片段和DNA
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E片段经过TaqDNALigase试剂进行成环反应，制得环状DNA。2.根据权利要求1所述体外快速合成环状DNA的方法，其特征在于，设计1/2A片段的引物设计为互补结构。3.根据权利要求1所述体外快速合成环状DNA的方法，其特征在于，步骤S1中所述PCR体系如下：2*PCR缓冲液forKODFX20
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30μL，2mMdNTPs8
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12μL，F
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Primer1
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2μL，R
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Primer1
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2μL，GenomicDNA180
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220ng，KODFX0.5
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1.5μL，ddH2O加至50μL。4.根据权利要求1所述体外快速合成环状DNA的方法，其特征在于，步骤S1中所述PCR反应条件为：90
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96℃，2min；95
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100℃，10s，50
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60℃，30s，65
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【专利技术属性】
技术研发人员：贺权源，左珊如，周军华，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：