一种辣椒腺苷三磷酸结合盒转运蛋白及基因和表达载体构建方法技术

一种辣椒腺苷三磷酸结合盒转运蛋白及基因和表达载体构建方法，它涉及基因工程领域，本发明专利技术要解决现有农作物抗盐碱能力差的问题，本发明专利技术的转运蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。编码转运蛋白的基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。表达载体构建：提取辣椒组织的总RNA，采用RT

【技术实现步骤摘要】
一种辣椒腺苷三磷酸结合盒转运蛋白及基因和表达载体构建方法


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种辣椒腺苷三磷酸结合盒转运蛋白及基因和表达载体构建方法。

技术介绍

[0002]全球土地有23％的盐土和37％的苏打土，盐碱地总面积约有10亿公顷，且每年以(1.0～1.5)
×
106hm2的速度增长(侯亚玲等，2018)。我国的盐碱地约有9914万hm2，约占全球盐碱地总面积的10％，居世界第三(张强等，2018)，特别是我国东北地区的盐碱地以苏打土为主。由于耕地有限，盐碱土地的开发利用显得尤为重要。绝大多数农作物对盐碱等逆境的耐受性差，造成作物大面积减产，土壤盐渍化已经成为制约农业发展的重要因素。
[0003]腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP
‑
binding cassette transporters,ABC转运蛋白)由于含有一个腺苷三磷酸(ATP)的结合盒(ATP
‑
binding cassete,ABC)而得名。ABC转运蛋白可分为八大亚族(亚家族A
‑
亚家族H)，是一个广泛存在于原核生物以及真核生物中超级大的家族蛋白，同时其是一组跨膜蛋白，具有ATP结合区域的单向底物转运泵，以主动转运方式将逆境胁迫因子的跨膜转运至体外。一个具有完整结构功能的ABC转运蛋白都具有四个基本的保守结构域结构，它们分别为两个高度疏水的跨膜结构域(Transmembrane domain，TMD)以及两个核苷酸结合域(Nucleotide
>‑
binding domain，NBD)。两个NBD与两个TMD具有多种的排列方式。在真核生物中，由一条多肽链构成的ABC转运蛋白主要有两种排列方式，一个是四个结构域的正向排列顺序(TMD
‑
NBD
‑
TMD
‑
NBD)，另一个反向排列顺序(NBD
‑
TMD
‑
NBD
‑
TMD)。ABC转运蛋白受各种调控水平及非生物胁迫响应的研究较多。2010年，GAO等从玉米中克隆并鉴定了一个ABC1基因(ZmABC1
‑
10)，表达模式分析表明ZmAbc1
‑
10在植物对H2O2、ABA、低温、干旱、高盐以及黑暗处理的适应中发挥重要作用。同年，Kang等报道了拟南芥中ABA响应的多向耐药PDR型ABC转运蛋白，主要在侧根和叶片中表达，尤其在保卫细胞中高表达。2007年，王彩香等的报道也显示，小麦TaABC1L基因对渗透、高盐、低温等逆境胁迫和NaCl处理均表现出应答反应，但是在不同胁迫条件下表达高峰出现的时间和表达强度上存在差异，其中受NaCl胁迫时基因的表达量变化最大。这些发现对提高植物的耐盐碱能力及其防御反应方面具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了解决现有农作物抗盐碱能力差的问题，而提供一种参与辣椒等植物盐碱胁迫反应相关的基因序列(如SEQ ID NO.1所示)及其编码的氨基酸序列(如SEQ ID NO.2所示)，为今后开发基因工程产品奠定基础。
[0005]一种辣椒腺苷三磷酸结合盒转运蛋白，所述的蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
[0006]编码权利要求1所述的一种辣椒腺苷三磷酸结合盒转运蛋白的基因，所述的转运
蛋白基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
[0007]采用一种辣椒腺苷三磷酸结合盒转运蛋白的基因构建表达载体的方法，该方法是按照以下步骤进行的：
[0008]步骤一、提取辣椒组织的总RNA，以总RNA为模板合成mRNA；
[0009]步骤二、以步骤一的mRNA为模板，采用RT
‑
PCR方法，获取得到辣椒腺苷三磷酸结合盒转运蛋白基因的片段；
[0010]步骤三、将得到的辣椒腺苷三磷酸结合盒转运蛋白基因的片段与载体连接，得重组质粒，然后转入到大肠杆菌中，通过筛选、鉴定后得到阳性重组子，即为所述的辣椒腺苷三磷酸结合盒转运蛋白的基因构建表达载体；
[0011]其中，RT
‑
PCR方法中的引物如下：
[0012]F:5
′‑
AGAGGAGGAATGGTTTGTTG
‑3′
；
[0013]R:5
′‑
AAGTGCCTTTGAGTTCGTTG
‑3′
。
[0014]进一步地，步骤二中所述的RT
‑
PCR的反应体系为：
[0015][0016]PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，72℃延伸10min，4℃终止反应，共30循环。
[0017]进一步地，所述的载体为pEASY
‑
T3。
[0018]进一步地，所述的通过筛选、鉴定后得到阳性重组子是指：
[0019]将重组质粒转入到大肠杆菌后，进行蓝白筛选，挑白斑进行菌液培养，提取质粒后，进行酶切鉴定，鉴定后的阳性样本进行测序，测序结果与辣椒腺苷三磷酸结合盒转运蛋白的基因进行比对，比对一致后，即完成所述的筛选、鉴定后得到阳性重组子；所述的辣椒腺苷三磷酸结合盒转运蛋白的基因核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
[0020]采用所获得的一种含有辣椒腺苷三磷酸结合盒转运蛋白的基因构建表达载体的酵母菌，将辣椒腺苷三磷酸结合盒转运蛋白的基因构建表达载体转入到酵母菌中，即得所述的含有辣椒腺苷三磷酸结合盒转运蛋白的基因构建表达载体的酵母菌。
[0021]本专利技术包含以下有益效果：
[0022]本专利技术通过现有的植物基因工程技术，利用ABCA19基因同源性设计特异引物，采用特异引物PCR技术分离与鉴定腺苷三磷酸结合盒转运蛋白基因CaABCA19的基因序列，并将辣椒腺苷三磷酸结合盒转运蛋白基因CaABCA19构建的载体转化到酵母菌中，研究发现
CaABCA19基因表达具有组织特异性且与胁迫反应密切相关，转化后的酵母菌具有抗盐碱胁迫及抗重金属胁迫的耐受性，说明本专利技术的辣椒腺苷三磷酸结合盒转运蛋白基因CaABCA19赋予了酵母菌抗盐碱胁迫及抗重金属胁迫的能力；可以通过该基因或其衍生物筛选或改良辣椒甚至其它植物，为将来培育具有盐碱胁迫耐受性和环境适应能力强的优良植物品种奠定了物质基础。
附图说明
[0023]图1是本专利技术的PCR扩增CaABCA19基因电泳图；图中，1表示PCR扩增产物，M表示Marker；
[0024]图2是本专利技术的CaABCA19蛋白亲疏水形状图；
[0025]图3是本专利技术的CaABCA19蛋白二级结构图；
[0026]图4是本专利技术的CaABCA19蛋白三级结构图；
[0027]图5是本专利技术的CaABCA19基因编码氨基酸序列及其与其它植物ABCA19基因同源性比较图；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种辣椒腺苷三磷酸结合盒转运蛋白，其特征在于所述的蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。2.编码权利要求1所述的一种辣椒腺苷三磷酸结合盒转运蛋白的基因，其特征在于所述的转运蛋白基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。3.采用权利要求2所述的一种辣椒腺苷三磷酸结合盒转运蛋白的基因构建表达载体的方法，其特征在于该方法是按照以下步骤进行的：步骤一、提取辣椒组织的总RNA，以总RNA为模板合成mRNA；步骤二、以步骤一的mRNA为模板，采用RT
‑
PCR方法，获取得到辣椒腺苷三磷酸结合盒转运蛋白基因的片段；步骤三、将得到的辣椒腺苷三磷酸结合盒转运蛋白基因的片段与载体连接，得重组质粒，然后转入到大肠杆菌中，通过筛选、鉴定后得到阳性重组子，即为所述的辣椒腺苷三磷酸结合盒转运蛋白的基因构建表达载体；其中，RT
‑
PCR方法中的引物如下：F:5
′‑
AGAGGAGGAATGGTTTGTTG
‑3′
；R:5
′‑
AAGTGCCTTTGAGTTCGTTG
‑3′
。4.根据权利要求1所述的一种辣椒腺苷三磷酸结合盒转运蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴鹏，郭茜茜，李诗佳，李冬雪，
申请(专利权)人：齐齐哈尔大学，
类型：发明
国别省市：