一种分子桥介导的赭曲霉毒素A检测方法及试剂盒技术

赭曲霉毒素A(OTA)在极低剂量下可对人体健康造成严重损害。开发一种超灵敏、简便、快速的OTA检测方法对食品质量与安全检测尤为重要。本发明专利技术构建了一种基于核酸适配体

【技术实现步骤摘要】
一种分子桥介导的赭曲霉毒素A检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于生物分析领域，具体涉及一种分子桥介导的赭曲霉毒素 A检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]赭曲霉毒素是一类由真菌产生的有毒的次级代谢产物，在粮食谷物中检出率高、污染范围广。其中赭曲霉毒素A(OTA)具有较强的毒性和生物富集作用，食品中低浓度的赭曲霉毒素A能威胁人们的身体健康，造成严重的安全事件。实现赭曲霉毒素A的实时快速检测对于控制食品安全具有重要意义。比色检测法通过溶液颜色改变而建立起来的一种分析方法，它可通过肉眼直接读数结果，不需要借助大型的检测仪器，以及具备操作简便、耗时短、成本低等优点，在现场快速检测中具有广阔的应用前景。目前，影响比色检测法应用的最大障碍是其较低的检测灵敏度，使其难以满足低浓度目标物的检测需求。
[0003]提高检测灵敏度对拓展比色检测法在食品安全领域的应用具有重要的意义。核酸扩增作为一种提高检测灵敏度的常用方法，为满足这一要求开辟了途径。核酸扩增辅助的传感器已经广泛用于低浓度的目标物检测，取得了令人满意的灵敏度、特异性和准确性。然而，基于核酸扩增技术的传感方法用于小分子检测通常需要借助特异性识别的核酸适配体(aptamer，Apt)，它是一种经指数富集配体系统进化技术筛选后获得的具有特定序列的寡核苷酸链。同时，核酸扩增技术所用的寡核苷酸链如Mg
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离子依赖性DNA酶(Mg
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dependentDNAzyme，MNAzyme)，也是具有特定序列的寡核苷酸链，要把两条具有特定序列的寡核苷酸链结合起来构建传感方法具有一定的挑战。
[0004]本专利技术利用两条寡核苷酸链作为分子桥，将Apt和MNAzyme结合起来，构建了一种基于Apt
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MNAzyme的比色传感方法，并成功应用OTA的高灵敏、快速检测。与传统的高效液相色谱法、气相色谱法等相比。该方法不需要昂贵仪器以及专业的技术人员，并具有灵敏度高、准确性好、检测速度快等优点，在食品安全检测、环境监测等领域具有广阔的应用前景。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的在于提供一种测定赭曲霉素A的可视化检测方法。为此，基于MNAzyme裂解策略，构建了一种比色传感技术检测OTA。如图1所示， Apt和MNAzyme通过分子桥(探针辅助探针DNA1和辅助探针DNA2)连接在一起形成稳定的四链体复合物。当不存在OTA时，MNAzyme被封闭而失去催化活性，不能对DNA底物HP进行切割产生信号；当存在OTA时，OTA会与 Apt结合释放出MNAzyme，从而在Mg
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的参与下催化裂解修饰有rA位点的 DNA底物HP，将其裂解成两个片段，MNAzyme重新结合新的底物HP启动下一轮催化裂解反应，经多轮循环裂解后，释放出大量的富G序列，该序列在hemin 和K
+
存在下形成hemin/G四链体DNA酶，并催化H2O2介导的生色底物ABTS 显色，溶液呈绿色。该方法在0.5nM
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25nM范围内，OTA的浓度与吸光度之间有良好的线性关系，检出限为0.41nM。大米中OTA的加标回收率在 93.6％
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108.6％范围内，说明该方法能较好地识别复杂体系中的OTA。
[0006]所述的识别探针Apt、辅助探针DNA1、辅助探针DNA2、MNAzyme 和DNA底物HP溶解于20mM的Tris
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HCl缓冲溶液(包含120mM NaCl、20mMKCl、20mM CaCl2、10mM MgCl2，pH＝7.4)中；所述的血红素溶于25mM HEPES 缓冲溶液(包含200mM NaCl、20mM KCl、0.05％Triton X
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100、1％DMSO， pH＝7.4)中。
[0007]所述DNA底物HP环部修饰有核糖核酸酶(rA)的裂解位点、茎部设计一段富含鸟嘌呤序列；所述识别探针Apt的序列为表一SEQ ID No.1所示的序列，所述辅助探针DNA1的序列为表一SEQ ID No.2所示的序列，所述辅助探针DNA2的序列为表一SEQ ID No.3所示的序列，所述MNAzyme序列为表一SEQ ID No.4，所述DNA底物HP序列为表一SEQ ID No.5。
[0008]所述的比色检测方法，优选的，所述的辅助探针DNA1、辅助探针 DNA2封闭MNAzyme碱基数为12、14、16、18nt；进一步优选为16nt。
[0009]所述的比色检测方法，优选的，所述的识别探针Apt、辅助探针 DNA1、辅助探针DNA2、MNAzyme浓度0、12.5、25、37.5、50、75nM；进一步优选为25nM。
[0010]所述的比色检测方法，优选的，所述DNA底物HP浓度为0、25、 75、125、175nM；进一步优选为125nM。
[0011]所述的比色检测方法，优选的，所述血红素浓度为62.5、125、250、 500、1250nM；进一步优选的所述氯化血红素浓度为125nM。
[0012]所述的比色检测方法，优选的，所述ABTS浓度为1、2、4、6、8mM，进一步优选为2mM。
[0013]所述的比色检测方法，优选的，所述过氧化氢浓度0.5、1、2、4、6 mM，进一步优选为1mM。
[0014]所述的比色检测方法，优选的，所述反应温度为4、25、37、45℃；进一步优选的反应温度为37℃。
[0015]所述的比色检测方法，优选的，所述反应时间30、60、90、120、150、 180min，进一步优选为120min。
[0016]作为同一技术构思，本专利技术还提供了一种赭曲霉毒素A检测试剂盒。所述试剂盒包括所述的检测方法中所述核酸序列和试剂。
[0017]所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器包含所述识别探针Apt、辅助探针DNA1、辅助探针DNA2、MNAzyme退火处理形成四链体复合物，使用前用Tris
‑
HCl缓冲液稀释成浓度为1μM。
[0018]所述试剂盒包括第二容器，所述第二容器包含所述DNA底物HP，使用前用Tris
‑
HCl缓冲液稀释成浓度为1μM。
[0019]所述试剂盒包括第三容器，所述第三容器包含所述氯化血红素，优选的所述氯化血红素溶于DMSO，使用前用HEPES缓冲液稀释成浓度为1μM。
[0020]所述试剂盒包括第四容器，所述第四容器包含所述生色底物2,2
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联氮
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二[3
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乙基
‑
苯并噻唑
‑6‑
磺酸]二铵盐(ABTS)，使用前用Tris
‑
HCl缓冲液稀释成浓度为10mM。
[0021]所述试剂盒包括第五容器，所述第五容器包含所述过氧化氢，使用前用Tris
‑
HCl缓冲液稀释成浓度为10mM。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种赭曲霉毒素A检测方法，其组成包括血红素、生色底物、识别探针Apt、Mg
2+
离子依赖性DNA酶和DNA底物HP，其特征在于其组成还包括分子桥，所述的识别探针Apt和所述的Mg
2+
离子依赖性DNA酶通过所述分子桥结合形成稳定四链体复合物；所述赭曲霉毒素A特异性结合识别探针Apt，释放出的Mg
2+
离子依赖性DNA酶催化所述DNA底物HP，生成大量的富G序列与所述血红素结合，催化所述生色底物显色。2.根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A检测方法，其特征在于所述识别探针Apt为SEQ ID NO:1所示序列，所述辅助探针DNA1为SEQ ID NO:2所示序列，所述辅助探针DNA2为SEQ ID NO:3所示序列，所述Mg
2+
离子依赖性DNA酶为SEQ ID NO:4所示序列，所述DNA底物HP为SEQ ID NO:5所示序列。3.根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A检测方法，其特征在于所述生色底物为2,2
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联氨
‑
二[3
‑
乙基苯并噻唑啉
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磺酸]二氨盐和过氧化氢。4.根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A检测方法，包括以下步骤：(1)所述的识别探针Apt、辅助探针DNA1、辅助探针DNA2、Mg
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离子依赖性DNA酶退火处理；(2)DNA底物HP退火处理形成发卡结构；(3)将经步骤(1)处理的所述识别探针Apt、辅助探针DNA1、辅助探针DNA2、Mg
2+
离子依赖性DNA酶混合，室温下反应形成四链体复合物；(4)待测样本加入经步骤(3)处理所得的四链体复合物和经步骤(2)处理的DNA底物HP；(5)将所述的血红素和生色底物加入反应溶液；(6)紫外可见分光光度计测定420nm的吸光度。5.根据权利要求4所述赭曲霉毒素A检测方法，其特征在于所述退火处理为95℃水浴5...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文山，李冬燕，夏怀月，孙盈盈，刘文杰，于建娜，敬国兴，刘文，黄师荣，
申请(专利权)人：湘潭大学，
类型：发明
国别省市：