一种构建Lrp5A241T基因点突变高骨量小鼠模型的方法技术

本发明专利技术提供了一种构建Lrp5A241T基因点突变高骨量小鼠模型的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术的方法较传统Cre/loxP系统操作更为简单，能够实现精准基因修饰，具有技术周期短、效率高的优点。此外，本发明专利技术构建的小鼠仅发生目的基因点突变，不携带其他基因修饰，同患者人群的真实突变一致，通过microCT等方式检测小鼠具有高骨量表征，对后续探究高骨量相关机制、研发相关靶向治疗药物或基因修饰疗法治疗骨质疏松等疾病、拓展LRP5高骨量突变的临床应用具有重要应用意义。用具有重要应用意义。用具有重要应用意义。

【技术实现步骤摘要】
一种构建Lrp5 A241T基因点突变高骨量小鼠模型的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种构建Lrp5 A241T基因点突变高骨量小鼠模型的方法。

技术介绍

[0002]跨膜受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5(Low
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density lipoprotein receptor
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related protein 5，LRP5)与骨密度密切相关，主要认为其通过经典Wnt/β
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catenin信号通路调控骨形成，LRP5功能获得性突变可引起骨密度增加、骨皮质增厚、骨硬度和抗骨折能力增强等高骨量表现，通常不伴视网膜、心脏等其他系统疾病，相关神经并发症主要由过度骨形成所致，整体表现为良性突变。
[0003]研究发现LRP5高骨量突变具有降低因老龄化、长期使用激素、绝经、废用性萎缩等引起的骨质疏松风险，可挽救成骨不良、Stat3缺失导致的骨骼缺陷等，还可延缓胰岛素缺乏小鼠血糖升高以及控制血糖水平，这可能与增强糖酵解作用相关，表明其在治疗骨质疏松、成骨不良、糖尿病等疾病中的潜在应用价值。此外，LRP5功能获得性突变还可能与软骨发育、牙齿发育关系密切，但具体作用及相关机制有待进一步探究。
[0004]LRP5 A242T(c.724G>A，p.Ala242Thr)是临床最常见的LRP5功能获得性突变之一，迄今为止已在8个家族中发现，除了骨密度增高、骨皮质增厚、抗折性能增强外，部分患者还表现出硬腭骨赘生物，不伴视网膜、心脏等系统并发症。现有技术已利用Cre/loxP系统与同源重组方法构建携带Lrp5 A214V和G171V突变的条件性敲入小鼠，探究高骨量小鼠的骨特性及相关机制，其原理是利用Cre/loxP系统构建转基因小鼠，首先设计并构建同源重组载体，需包含目标突变基因和两端携带loxP修饰的新霉素抗性基因(Neomycin
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resistance cassette，NeoR)，NeoR的转录方向同目标基因相反并由强启动子驱动，或者loxP方向同目标基因相反，从而干扰目标基因表达。将同源重组载体显微注射至胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ESCs，简称ES细胞)进行基因改造，筛选并验证中靶的阳性ES细胞，然后将阳性ES细胞注射到小鼠囊胚腔中，将获得的小鼠囊胚移植到假孕母鼠子宫内，获得并验证阳性F0代转基因小鼠，该小鼠仅携带但不表达目标突变基因。该F0代小鼠同野生型小鼠杂交获得稳定遗传的F1代，之后还需同Cre小鼠杂交获得F2代杂合子小鼠，F2代通过自交获得同时携带目标基因和Cre纯合子基因，表达的Cre重组酶可识别两个loxP位点，从而去除loxP和NeoR，使目的基因稳定表达。该过程往往需繁殖多代方可获得目标转基因小鼠，技术周期长，且引入筛选基因如NeoR，同患者人群的真实突变存在差异。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种构建Lrp5 A241T基因点突变高骨量小鼠模型的方法，本专利技术的方法周期短、且不携带其他基因修饰，小鼠Lrp5中的氨基酸A241与人LRP5的A242相对应，本专利技术的方法构建的小鼠同患者人群的真实突变一致。
[0006]本专利技术提供了一种构建Lrp5 A241T基因点突变高骨量小鼠模型的方法，包括以下
步骤：
[0007]将Cas9 mRNA、Donor DNA和guideRNA混合后对供体小鼠的受精卵进行显微注射，再将显微注射后的受精卵移植到假孕母鼠中，繁殖子代，得到Lrp5 A241T基因点突变高骨量小鼠模型；
[0008]所述Donor DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0009]所述guideRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]优选的，所述繁殖子代包括对繁殖获得的F0代小鼠进行基因型鉴定，选取其中携带A241T突变的阳性小鼠与野生型小鼠交配，获得稳定遗传Lrp5 A241T突变的F1代杂合子小鼠。
[0011]优选的，所述野生型小鼠包括C57BL/6J小鼠。
[0012]优选的，所述供体小鼠包括C57BL/6J小鼠。
[0013]本专利技术还提供了上述方案所述的方法得到的Lrp5 A241T基因点突变高骨量小鼠模型在Lrp5A241T基因点突变相关的高骨量形成机制及骨质疏松治疗药物研究中的应用。
[0014]本专利技术还提供了一种基于CRISPR/Cas9技术制备Lrp5 A241T基因点突变高骨量小鼠模型的试剂盒，所述试剂盒中包括识别Lrp5 exon4目标位点区域的guideRNA，所述guideRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述Lrp5 exon4的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0015]优选的，所述试剂盒还包括Cas9 mRNA和Donor DNA；所述Donor DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0016]本专利技术提供了一种构建Lrp5 A241T基因点突变高骨量小鼠模型的方法，包括以下步骤：将Cas9 mRNA、Donor DNA和guideRNA混合后对供体小鼠的受精卵进行显微注射，再将显微注射后的受精卵移植到假孕母鼠中，繁殖子代，得到Lrp5 A241T基因点突变高骨量小鼠模型；所述Donor DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述guideRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本专利技术利用CRISPR/Cas9技术，通过构建打靶载体，利用同源重组修复方式引入LRP5目的点突变，从而获得Lrp5 A241T基因点突变的杂合子小鼠。本专利技术的方法较传统Cre/loxP系统操作更为简单，能够实现精准基因修饰，具有技术周期短、效率高的优点。此外，本专利技术构建的小鼠仅发生目的基因点突变，不携带其他基因修饰，同患者人群的真实突变一致，通过microCT等方式检测小鼠具有高骨量表征，对后续探究高骨量相关机制、研发相关靶向治疗药物或基因修饰疗法治疗骨质疏松等疾病、拓展LRP5高骨量突变的临床应用具有重要应用意义。
附图说明
[0017]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0018]图1表示突变型和野生型基因及引物设计示意图；
[0019]图2为水平电泳检测结果；
[0020]图3为野生型基因组序列和突变后实际测序结果；
[0021]图4为野生型小鼠突变位点附近峰形图；
[0022]图5为Lrp5 A241T杂合子小鼠突变位点附近峰形图；
[0023]图6为LRP5 A241T杂合子和野生型小鼠体型比较，其中A.野生型和突变杂合子小鼠；B.突变组小鼠身高与对照组无显著差异；C.突变组小鼠体重与对照组无显著差异；<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建Lrp5 A241T基因点突变高骨量小鼠模型的方法，包括以下步骤：将Cas9 mRNA、Donor DNA和guideRNA混合后对供体小鼠的受精卵进行显微注射，再将显微注射后的受精卵移植到假孕母鼠中，繁殖子代，得到Lrp5A241T基因点突变高骨量小鼠模型；所述Donor DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述guideRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述繁殖子代包括对繁殖获得的F0代小鼠进行基因型鉴定，选取其中携带A241T突变的阳性小鼠与野生型小鼠交配，获得稳定遗传Lrp5 A241T突变的F1代杂合子小鼠。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述野生型小鼠包括C57BL/6J小鼠。4.根据权利要求1所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨国利，姜治伟，王雪婷，傅梦蝶，贺瑾，李娜，叶钰儿，潘奕祺，张回，张芩梦，陈朝真，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属口腔医院，
类型：发明
国别省市：