用于损伤修复的脐带间充质干细胞上清液、其产品及制法制造技术

本发明专利技术属于生物医疗美容产品技术领域，具体涉及一种用于损伤修复的脐带间充质干细胞上清液、其产品及制法。所述的用于损伤修复的脐带间充质干细胞上清液的制备方法包括：(1)原代培养；(2)传代培养；(3)饥饿培养。本发明专利技术方法制备的上清液中含有多达几百种细胞因子以及外泌体在内的丰富的细胞活性物质，具有突出地平衡调节细胞生长活化作用，用于损伤修复效果显著，且不含外来培养基和细胞组分，皮肤使用安全性高，产品批次之间质量稳定，并且可进一步制成活性物质保存完好的冻干粉形式长期保存。保存。保存。

【技术实现步骤摘要】
用于损伤修复的脐带间充质干细胞上清液、其产品及制法


[0001]本专利技术属于生物医疗美容产品
，具体涉及一种用于损伤修复的脐带间充质干细胞上清液、其产品及制法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的多能干细胞，具有自我复制和分化潜能的干细胞共性，可刺激组织生长和修复，增强组织的再生能力，影响免疫调节，在细胞治疗领域有着极为广阔的应用前景。间充质干细胞具有强大的旁分泌作用，干细胞的旁分泌效应，能够表达、合成、分泌各类生长因子、细胞因子、调节因子、趋化因子、信号肽等多种生物活性因子。
[0003]细胞上清液是细胞培养的营养液，细胞增殖过程中的营养吸收和活性因子的分泌都是在上清液中进行交换和完成的。所以，培养间充质干细胞的培养上清液中含有多种有效的细胞因子和外泌体。
[0004]细胞因子：由干细胞合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，是上清液中富含细胞活性关键的信息传递物质，对体内受到损伤的组织和细胞的功能恢复起到重要作用。
[0005]细胞生长因子是通过改变细胞微环境来增强细胞生长、分化和组织修复的化学信使，外泌体已被证明在细胞间通讯和细胞复制、分化以及凋亡的调节中起重要作用。来源于干细胞的外泌体在皮肤领域中可能具有潜在的治疗作用。
[0006]外泌体：是干细胞分泌的微小的囊泡(宽30至150nm)，它们类似细胞间的“通信兵”，可以在细胞之间转移DNA、RNA或蛋白质(包括细胞因子)，从而影响受体细胞的功能。
[0007]外泌体在疤痕修复中的应用：外泌体介导的巨噬细胞、纤维细胞和成纤维细胞/肌成纤维细胞之间的细胞间通讯对于瘢痕形成至关重要。多项临床前研究证实干细胞衍生的外泌体有助于促进胶原蛋白和弹性蛋白产生，防止皮肤纤维化从而达到修复疤痕，促进伤口愈合目的。
[0008]外泌体在皮肤再生中的应用：通过外泌体调节人真皮成纤维细胞(HDF)的特性可能具有抗衰老疗法的潜力。来源于HDF球状体的外泌体通过上调TGF
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β和下调TNF
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α，导致裸鼠光老化模型中I型原胶原的产生增加和基质金属蛋白酶
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1的表达降低，从而起到抗衰老作用。胚胎干细胞来源的外泌体通过调节HDF中的TGF
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β2受体改善衰老特征。
[0009]外泌体在色素沉着中的应用：角质形成细胞来源的外泌体在黑色素细胞产生色素中起着重要作用。多项研究发现角质形成细胞来源的外泌体可以通过分泌一些因子或增加RNA的表达，如增加miR
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330
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5p、miR
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675等的表达来减少黑色素产生和减少酪氨酸酶基因表达减少等，从而发挥淡化色素沉着作用。
[0010]间充质干细胞的培养上清液中含有大量细胞活性物质细胞因子，主要功能是加速修复，促进细胞活化，让细胞存活率更高，从而达到“逆生长”的效果。最值得一提的是，单一细胞因子所起的是单一刺激作用，譬如生长因子，作用过强和过于持久时，会引起组织过度
生长，但是由于干细胞上清液里细胞因子种类丰富，既有强化的，也有抑制的，所以其是平衡调节细胞生长活化的，而外泌体除了自有的调节功能外，它的囊泡运输机制可以顺利穿越人体组织屏障，打开细胞信号通道，调控细胞的功能，使细胞因子等能更好地作用于细胞。上清液中的细胞因
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和外泌体拥有细胞分泌出来的蛋
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质,可以调节细胞的增殖及分化，恢复细胞的活跃程度，也称作“活性因子”或“修复因子”。萃取提炼之后具有重建功能细胞、延缓衰老、抗皱美容的效果。可以做到如下功能：1、针对受损毛细血管修复，让肌肤从里到外焕然新生；2、从表皮到真皮层发生根本改善，恢复肌肤水嫩细腻；3、改善衰老造成的面部色素沉积。
[0011]间充质干细胞的培养上清液中含有的活性因子具有不同的生物学活性及作用，具有促进表皮干细胞增殖，促进皮肤新陈代谢，增强皮肤细胞的活力，促进细胞物质成份交换以增强皮肤对其他营养物质的吸收，以及机体代谢废物的排放。这些功能对于美容抗衰老功能巨大，可以促进皮肤创伤修复，促进皮下胶原再生，抑制细胞凋亡，增强抗氧化能力等。
[0012]间充质干细胞上清液液经过冻干工艺后不含水分，不会滋生微生物，无需添加防腐剂、增稠剂、更不添加香精、色素、酒精等，杜绝一切有可能的刺激，适宜于脆弱、敏感肌肤。
[0013]通过低温锁鲜固态冻干工艺，融合多重功效精华成分，将其配方中的水分完全抽离后，采用冻干技术有效保存其活性，将细胞生长因子、外泌体、小分子肽、透明质钠酸等数种经典精粹封存于固态精华之中，真正实现了零防腐剂和零添加配方，将有效活性成分固态形式保存，在这过程中去除水份，保留精华成分，遇溶媒之后成为释放有效成分的精华液，让肌肤更好地吸收。起到的作用有：
[0014]补水保湿。科学选配能够透皮吸收，可以渗透到肌底补水养护，软化皮肤的角质层，恢复老化皮肤的角质异常，恢复角质层保湿功能正常。
[0015]深层修护。有时候熬夜的皮肤必然受损，多种成份糅合，巩固修复损伤细胞，促进细胞的新陈代谢，减少老化痕迹。
[0016]抗氧化和抗老化。熬夜会导致体内自由基增多，与此同时，皮肤中的自由基平衡也会被打破，引起肌肤衰老，皮肤衰老的表现是松弛、出现皱纹，该成分可以即时细纹修复，紧致提拉。
[0017]强韧肌肤屏障。核心成分有效的针对熬夜皮肤问题进行作用，增强皮肤的屏障作用，达到活肤的功效。
[0018]现阶段，间充质干细胞的培养上清液在美容抗衰老领域应用前景广阔，但在应用中还存在以下问题：1)难以长期保存；本专利通过低温冻干方法有效解长期保存的问题。2)一般间充质干细胞的培养上清液中含有外来培养细胞培养基，其中还有酚红等外来培养基成份，也可能含有死细胞裂解成份，这些外来添加剂和细胞裂解毒素容易对皮肤造成伤害；通过本专利方法得到的间充质干细胞上清液不含有酚红和外来添加剂、也不含防腐剂，成份安全。3)间充质干细胞批次之间的质量不稳定，难以保证细胞产品的使用效果和安全性；本专利细胞制备工艺稳定，从培养基到所使用试剂辅料多次通过实验验证细胞批次间的稳定性。4)冻干制备活性因子的功能效力。本专利冻干成份按照一定成份配比，在其低温冻干过程中生物活性成份被保护稳定起来，使用时和溶媒配合使用，能有效保护各活性因子的功能。

技术实现思路

[0019]本专利技术的目的在于针对现有技术中存在的上述问题，提供一种用于损伤修复的脐带间充质干细胞上清液、其产品及制法。
[0020]本专利技术的第一目的，提供一种用于损伤修复的脐带间充质干细胞上清液的制备方法，包括如下步骤：
[0021](1)原代培养：从脐带中分离华通氏胶组织并剪成组织块，铺至培养瓶中，然后加入培养基进行贴壁培养至脐带间充质干细胞长满50
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60％培养瓶底面积，得到P0代脐带间充质干细胞；优选的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于损伤修复的脐带间充质干细胞上清液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)原代培养：从脐带中分离华通氏胶组织并剪成组织块，铺至培养瓶中，然后加入培养基进行贴壁培养至脐带间充质干细胞长满50
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60％培养瓶底面积，得到P0代脐带间充质干细胞；(2)传代培养：a)弃去培养基，然后依次加入洗涤液洗涤、加入消化液消化、加入终止消化液终止消化、离心收集细胞沉淀，以及用培养基将细胞沉淀重悬后，接种至新的培养瓶中进行传代培养；b)待脐带间充质干细胞长满70
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80％培养瓶底面积时重复步骤a)，经连续5次传代培养，得到P5代脐带间充质干细胞；(3)饥饿培养：待P5代脐带间充质干细胞长满培养瓶70
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80％面积时，弃去培养基进行饥饿培养，所得培养液离心去除细胞沉淀后，即得到所述用于损伤修复的脐带间充质干细胞上清液；所述原代培养和传代培养中采用的培养基均为无血清培养基，所述无血清培养基包括：基础培养基Biological IndustriesMSCXF Basal Medium、重组因子MSCXF Suppl.Mix和血清替代物HELIOS UltraGRO
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PURE GI，所述的基础培养基、重组因子和血清替代物的体积比为500:3:10。2.根据权利要求1所述用于损伤修复的脐带间充质干细胞上清液的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将组织块均匀铺到T225通气细胞培养瓶中，每瓶加入10mL培养基，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，每2
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3天补加培养基3
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4mL。3.根据权利要求1所述用于损伤修复的脐带间充质干细胞上清液的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，洗涤液为HBSS，洗涤次数为2次；消化液为...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙洪涛，牛翰婕，王景景，任党利，李泽萌，李锐，屈阳，李建伟，刁云锋，陈翀，
申请(专利权)人：中国人民武装警察部队特色医学中心，
类型：发明
国别省市：