外源抗凋亡基因BIR1在提高盾壳霉生防作用中的应用制造技术

本发明专利技术提供了外源抗凋亡基因BIR1在提高盾壳霉生防作用中的应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术提供了外源抗凋亡基因BIR1在提高盾壳霉生防作用中的应用，具体地包括，PCR扩增得到BcBIR1基因cDNA的全部序列，构建含有BcBIR1基因的表达载体，通过遗传转化的方法将载体整合入盾壳霉基因组中获得表达BcBIR1基因的盾壳霉菌株Bcbir1

【技术实现步骤摘要】
外源抗凋亡基因BIR1在提高盾壳霉生防作用中的应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及外源抗凋亡基因BIR1在提高盾壳霉生防作用中的应用。

技术介绍

[0002]核盘菌寄主范围十分广泛，除侵染十字花科植物外，也可侵染菊科、豆科、茄科和百合科等19个科的植物，其中包含很多重要的经济作物。因其寄主范围广泛，且产生的菌核抗逆性极强，可在土壤中长期存活，因此由核盘菌引起的菌核病防治极其困难。目前，防治油菜菌核病的主要方法仍是化学防治和轮作，但农药残留会对环境造成污染并且轮作的防治效果也不稳定，所以生物防治方法越来越被人们所重视。
[0003]盾壳霉是一种重要的重寄生真菌，其寄主范围较窄，主要为核盘菌属以及小核盘菌属真菌，也能轻微寄生葡萄孢属真菌。盾壳霉可有效寄生核盘菌的菌丝和菌核，使核盘菌的菌丝降解、菌核腐烂，此外还可抑制油菜花瓣上核盘菌子囊孢子的初侵染，从而防止油菜菌核病的发生。在油菜叶面喷施盾壳霉孢子悬浮液后，其孢子可受核盘菌的刺激萌发并寄生和破坏病斑上再侵染的核盘菌菌丝，达到控制菌核病再侵染的效果。
[0004]有研究表明，在盾壳霉中持续表达一个与铁载体介导的铁转运相关的基因CmSIT1，会导致其菌丝生长速率变慢，但抗真菌能力增强；Vam6p/Vps39p的同源基因CmVps39，PacC的同源基因CmpacC都在盾壳霉重寄生核盘菌过程中起重要作用，CmVps39还可以调节盾壳霉菌丝的液泡形态，维持渗透和调节pH并且参与细胞的自噬，影响盾壳霉的产孢、孢子萌发等；CmpacC则能阻止草酸的降解并且降低盾壳霉的抗真菌活性；Cmoxdc1和Cmoxdc2是盾壳霉中参与草酸降解的2个关键基因，其中Cmoxdc1参与降解草酸，将盾壳霉中的Cmoxdc1基因敲除后，由于草酸的积累减弱了盾壳霉对核盘菌的重寄生能力。与此一致的是，盾壳霉Cmoxdc1敲除突变体，在草酸存在的条件下，产生抗真菌物质的能力增强。此外，有研究表明CmMR1与盾壳霉黑色素合成相关，敲除CmMR1的突变体抗紫外线能力下降，使得在田间喷施盾壳霉孢子防治菌核病变得困难。所以对盾壳霉进行遗传改良，提高其生长速度、抗紫外线能力和产生抗生物质能力以及重寄生能力等极为重要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的提供外源抗凋亡基因BIR1在提高盾壳霉生防作用中的应用，表达外源基因BIR1可提高生防真菌盾壳霉生长速率、产孢能力、寄生能力及抗逆能力，从而提高盾壳霉对菌核病的生防能力。
[0006]本专利技术提供了外源抗凋亡基因BIR1在提高盾壳霉生防作用中的应用。
[0007]优选的，所述外源抗凋亡基因BIR1包括灰葡萄孢抗凋亡基因BcBIR1。
[0008]优选的，所述提高盾壳霉生防作用包括提高生防真菌盾壳霉的生长速率、产孢能力、寄生能力和抗逆能力。
[0009]本专利技术还提供了一种包含外源抗凋亡基因BIR1的重组载体。
[0010]本专利技术还提供了上述重组载体的构建方法，包括以下步骤：PCR扩增灰葡萄孢抗凋亡基因BcBIR1的cDNA完整序列，经Kpn1酶酶切后，将酶切后的基因片段连接到基础载体上，得所述重组载体。
[0011]优选的，所述PCR扩增的方法，包括：提取灰葡萄孢菌株的RNA，反转录成cDNA后作为扩增模板，进行扩增。
[0012]优选的，所述PCR扩增所用的引物对包括Bcbir1
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F和Bcbir1
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R，Bcbir1
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，Bcbir1
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0013]本专利技术还提供了一种表达外源抗凋亡基因BIR1的重组盾壳霉的构建方法，包括以下步骤：将上述重组载体经农杆菌介导的转化方法转入盾壳霉菌株的分生孢子中。
[0014]优选的，在所述转化后，还包括利用潮霉素抗性标记进行筛选。
[0015]本专利技术还提供了利用上述构建方法得到的表达外源抗凋亡基因BIR1的重组盾壳霉。
[0016]有益效果：本专利技术提供了外源抗凋亡基因BIR1在提高盾壳霉生防作用中的应用，具体地包括，PCR扩增得到BcBIR1基因cDNA的全部序列，构建含有BcBIR1基因的载体，通过遗传转化的方法将载体整合入盾壳霉基因组中获得表达BcBIR1基因的盾壳霉菌株Bcbir1
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12和Bcbir1
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17。通过一系列生物学实验证实表达BcBIR1基因可提高生防真菌盾壳霉生长速率、产孢能力、寄生能力及抗逆能力，从而显著提高盾壳霉的生防能力。
附图说明
[0017]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0018]图1为BcBIR1在盾壳霉中的表达模式，其中A.BcBIR1结构示意图；B.BcBIR1过表达结构示意图；C.通过Southern Blot确认BcBIR1表达载体在转基因菌株Bcbir1
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12和Bcbir1
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17中的单次插入；D.盾壳霉菌株中肌动蛋白actin、潮霉素抗性基因hph和BcBIR1的DNA和mRNA的检测；E.qRT
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PCR引物对的特异性；F.基因CmBIR1在盾壳霉菌株中的动态表达情况；
[0019]图2为盾壳霉菌株的菌落形态、生长速率、菌丝尖端和产孢，其中A.菌株ZS
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1、Bcbir1
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12和Bcbir1
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17在20℃条件下PDA培养基上接种10天后的菌落形态；B.在接种后第3天和第10天分别测量菌株ZS
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1、Bcbir1
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12和Bcbir1
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17的菌落直径，计算每个菌株的生长速率；C.菌株ZS
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1、Bcbir1
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12和Bcbir1
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17在20℃条件下PDA培养基上培养4天后观察菌丝尖端，比例尺＝500μm；D.菌株ZS
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1、Bcbir1
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12和Bcbir1
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17的生物量；每个菌株将1mL分生孢子悬浮液(106个分生孢子/mL)接种到20mL马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)中20℃150rpm条件下摇培，分别在4、7和10天收获、干燥并称重菌株的菌丝体重量；E.菌株ZS
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1、Bcbir1
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12和Bcbir1
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17的分生孢子形态，在15天时从PDA板上收集ZS
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1、Bcbir1
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12和Bcbir1
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17菌株的分生孢子并成像，比例尺＝5μm；F.菌株ZS
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.外源抗凋亡基因BIR1在提高盾壳霉生防作用中的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述外源抗凋亡基因BIR1包括灰葡萄孢抗凋亡基因BcBIR1。3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述提高盾壳霉生防作用包括提高生防真菌盾壳霉的生长速率、产孢能力、寄生能力和抗逆能力。4.一种包含外源抗凋亡基因BIR1的重组载体。5.权利要求4所述重组载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：PCR扩增灰葡萄孢抗凋亡基因BcBIR1的cDNA完整序列，经Kpn1酶酶切后，将酶切后的基因片段连接到基础载体上，得所述重组载体。6.根据权利要求5所述构建方法，其特征在于，所述PCR扩增的方法，包括：提取灰葡萄孢菌株的RNA，反转录成cDNA后作为扩增模板，进行扩增。7.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜道宏，武佳宁，林杨，付艳苹，程家森，谢甲涛，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：