一种与结球甘蓝开花早晚紧密相关的分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，具体涉及与结球甘蓝开花早晚相关的分子标记。该分子标记核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术从极端早花和极端晚花的结球甘蓝中克隆了BoTTG1的基因序列及其启动子序列，结果发现早/晚花的BoTTG1基因序列一致，而启动子区域存在341bp的插入/缺失。根据这段插入/缺失序列设计了InDel

【技术实现步骤摘要】
No.1所示的序列，则为晚花结球甘蓝材料，若PCR扩增片段中不含有SEQ ID No.1所示的序列，则为早花结球甘蓝材料。
[0011]在本专利技术一个具体实施方案中，以结球甘蓝基因组DNA为模板，利用所述的引物进行PCR扩增，产物经电泳检测，若出现136bp的目标片段则为早花结球甘蓝材料；若出现477bp的目标片段则为晚花结球甘蓝材料。
[0012]本专利技术在极端晚开花和极端早开花结球甘蓝中分别克隆的BoTTG1基因的编码区和启动子序列，测序后进行比对，发现早晚花的BoTTG1编码区序列一致，而启动子区域存在341bp的插入/缺失。根据这段插入缺失序列设计了InDel
‑
TTG1标记，该标记在极端早花甘蓝中PCR产物为136bp(早花标记)，极端晚花甘蓝中的PCR产物为477bp(晚花标记)。将该标记用于89份结球甘蓝自交系群体中，筛选出40份结球甘蓝含有早花标记和49份结球甘蓝含有晚花标记。连续统计三年的开花期发现，含早花标记的结球甘蓝平均开花期显著早于含晚花标记的结球甘蓝(早花
2019
＝201.20
±
7.76天，晚花
2019
＝205.45
±
8.73天，P<0.05；早花
2020
＝201.13
±
7.69天，晚花
2020
＝204.29
±
7.37天，P<0.05；早花
2021
＝189.9
±
6.06天，晚花
2021
＝193.82
±
6.89天，P<0.05)；并且晚花标记与开花期显著正相关r
2019
＝0.249，P<0.05；r
2020
＝0.207，P＝0.052；r
2021
＝0.289，P<0.01)，早花标记与开花期显著负相关r
2019
＝
‑
0.249，P<0.05；r
2020
＝
‑
0.207，P＝0.052；r
2021
＝
‑
0.289，P<0.01)。确证该分子标记与开花期早晚密切相关。
附图说明
[0013]图1是实施例1中，引物对(BoTTG1
‑
F1+BoTTG1
‑
R1)PCR扩增BoTTG1基因编码区域序列产物，引物对(BoTTG1
‑
P
‑
F1+BoTTG1
‑
P
‑
R1)PCR扩增BoTTG1基因启动子区域序列产物。
[0014]图2是实施例1涉及引物在BoTTG1基因启动子序列上的位置。
[0015]图3是实施例1早花、晚花结球甘蓝差异片段序列比对图，虚线部分为早花结球甘蓝缺失的341bp片段。
[0016]图4是实施例1涉及的差异区段位置，其中黑色区域表示BoTTG1基因编码区域。
[0017]图5是实施例3InDel
‑
TTG1标记引物对PCR扩增BoTTG1基因启动子缺失片段区域序列产物；其中，M代表DL5000DNAMarker，E和Early代表早开花结球甘蓝，L和Late代表晚开花结球甘蓝。
[0018]图6是实施例3InDel
‑
TTG1标记与结球甘蓝自然群体开花期的关系。
具体实施方式
[0019]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。
[0020]实施例1 BoTTG1基因差异片段的锚定
[0021](1)根据BoTTG1参考基因组序列，采用Oligo7在线引物设计软件，设计引物BoTTG1基因引物(Forward primer：5
’‑
CGCCATGGACAACTCAGCTCCG
‑3’
，Reversed primer：5
’‑
CGCGGATCCTCAAACTCTGAGGAGCT
‑3’
)，采用20μl PCR反应体系(ddH2O：4.2μl；2
×
Phanta Max buffer：10μl；dNTP Mix(10mM each)：0.4μl；Primer F(10μM)：1μl；Primer R(10μM)：1μl；Phanta max super
‑
fidelity DNA Polymerase(1U/μl)：0.4μl；DNA(100ng/μl)：3μl)，和PCR反应程序(95℃5min，{95℃15s，55℃30s，72℃1min}
×
34cycles，72℃10min，16℃保存)
下，在极端早花(F416)和晚花(P1)结球甘蓝的基因组DNA中扩增BoTTG1基因序列，1％琼脂糖凝胶电泳成像，结果见图1，早花和晚花结球甘蓝编码区域扩增片段大小约1.0kb，大小无差异；华大基因测序发现序列完全一致。
[0022](2)根据BoTTG1参考基因组启动子区域序列，采用Oligo7在线引物设计软件，设计BoTTG1启动子引物(Forward primer:5
’‑
TGAGGGGTTCAAATCACGGG
‑3’
，Reversed primer:5
’‑
GAAGGACATCGCGTAGAGGG
‑3’
)(位置见图2)，采用20μl反应体系(ddH2O：4.2μl；2
×
Phanta Max buffer：10μl；dNTPMix(10mM each)：0.4μl；Primer F(10μM)：1μl；Primer R(10μM)：1μl；Phanta max super
‑
fidelity DNA Polymerase(1U/μl)：0.4μl；DNA(100ng/μl)：3μl)，和PCR反应程序(98℃5min，{98℃15s，65℃30s
‑
1℃/c，72℃2min}
×
10cycles，{98℃15s，55℃30s，72℃2min}
×
20cycles，72℃10min，16℃保存)下，在极端早花(F416)和晚花(P1)结球甘蓝的基因组DNA中扩增BoTTG1基因启动子区域，1％琼脂糖凝胶电泳成像，结果见图1，早花和晚花结球甘蓝启动子区域扩增片段大小差异不明显，扩增片段大小约为2700bp；克隆启动子序列后送华大基因测序，测序结果发现早花甘蓝材料比晚开花甘蓝缺失了341bp，结果见图3
‑
4，初步推测这341bp大小的差异片段可能与甘蓝开花期有关。
[0023]实施例2 BoTTG1启动子BoTTG1
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种与结球甘蓝开花期早晚相关的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.扩增含有权利要求1所述分子标记的引物对，其特征在于，正向引物序列如SEQ ID No.2所示，反向引物序列如SEQ ID No.3所示。3.权利要求1所述分子标记在结球甘蓝开花期早晚标记选择中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：以结球甘蓝基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的引物序列进行PCR扩增，产物经电泳检测，若出现136bp的目标片段则为早花结球甘蓝材料；若出现477bp的目标片段则为晚花结球甘蓝材料。5.一种结球甘...

【专利技术属性】
技术研发人员：李勤菲，杨家勤，宋洪元，任雪松，司军，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：