亲水改性疏水聚合物基质ProteinA亲和层析介质制造技术

本发明专利技术涉及一种亲水改性疏水聚合物基质Protein A亲和层析介质的制备方法及其应用。制备步骤包括：1)尺寸分布均匀，高度交联的多孔疏水聚合物微球的制备；2)用稀释的含有适度疏水改性的琼脂糖或类似物质或混合物的水溶液对步骤1中制备的多孔微球进行含浸；3)对改性后的多孔微球表面以及内孔表面覆盖的改性成分进行交联反应；4)对表面交联后的多孔微球进行环氧官能团接枝反应；5)最后进行Protein A接枝反应。该方法制备的Protein A亲和层析介质，其具有耐碱，耐酸，机械强度高，非特异性吸附低，对生物大分子的快速分离连续层析效率高，寿命长，应用前景广阔。应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
亲水改性疏水聚合物基质Protein A亲和层析介质


[0001]本专利技术涉及一种亲水改性疏水聚合物基质Protein A亲和层析介质的制备以及应用，该介质具备优异的耐酸碱性，表面具有优异的生物相容性，亲水性，以及非特异性吸附低，机械强度高，对特异性吸附效率高等特性，适合生物大分子蛋白，特别是抗体的高效提纯。

技术介绍

[0002]表面修饰Protein A的亲和层析介质，由于其优异的特异性吸附功能，是分离生物大分子蛋白比如抗体的首选分离提纯手段。为了提高分离效率经常使用连续流层析。层析过程中，在一定的压力下，含有目标分子的液体以一定的流速流过含有层析介质的装填柱，由于 Protein A对目标分子的高效吸附而被获取，然后进行洗脱，再用碱性水溶液进行清洗多次后重复使用。在这种工作条件下，要求层析介质具有足够的机械强度，耐碱性，尺寸分布均匀，表面生物相容性好，非特异性吸附低等特点。
[0003]目前常用的技术方案包括：交联琼脂糖颗粒表面结合Protein A(CN00574840C)，交联甲基丙烯酸酯类共聚物颗粒表面结合Protein A(US20130085199A1，CN112341663A)，交联聚乙烯醇共聚物表面结合Protein A(EP338971A1)。
[0004]专利CN00574840C中介绍的以交联琼脂糖颗粒为基质的结合Protein A的亲和层析介质，生物相容性好，非特异性吸附低，表面亲水，特异性吸附效率高。但是由于琼脂糖的特殊分子结构，其强度不足，在压力下易变形，导致压降升高，分离效率下降。
[0005]专利US20130085199A1与专利CN112341663A介绍的Protein A亲和层析介质都是基于交联甲基丙烯酸酯类共聚物颗粒，由于酯键的存在，其耐碱性有待进一步提升，另外由于交联度的限制，机械强度也有改善空间。专利US20130085199A1介绍的层析介质表面没有被羟基完全覆盖，非特异性吸附有待改善。
[0006]专利EP338971A1介绍一种基于交联的聚乙烯醇共聚物颗粒做为基质，由于该机制交联度不足，机械强度需要进一部提升，耐碱性也需要改善，并且表面没有被羟基完全覆盖，有疏水区域，非特异性吸附较多。

技术实现思路

[0007]基于此，本专利技术提供了一种方法，制备了一种高度交联的疏水性强的多孔聚合物颗粒，并且在颗粒表面上覆盖生物相容性好的物质比如琼脂糖并进行化学交联，以提升附着强度，然后再接枝Protein A。这样制备的微球，优化了耐碱性，机械强度，表面生物相容性，降低非特异性吸附，同时提升Protein A的耐碱性，提升了特异性吸附的效率。
[0008]本专利技术Protein A亲和层析介质制备方步骤如下：1)尺寸分布均匀，高度交联的疏水多孔聚合物微球的制备；2)用稀释的含有适度疏水改性的琼脂糖或葡聚糖或类似结构物质或两种及多种混合水溶液对步骤1中制备的多孔微球进行含浸，使步骤1的多孔微球表面和内孔表面都覆盖丰富的羟基；3)对改性后的多孔微球表面以及内孔表面覆盖的改性富含
羟基成分进行交联反应；4)对表面交联后的多孔微球进行环氧官能团接枝反应；5)最后进行ProteinA接枝反应。
[0009]在步骤1中，为了制备高度交联，尺寸分布均匀，疏水性强的多孔微球，需要优化合成方法，合成配方，工艺以及反应条件，以获得颗粒大小适中，尺寸分布均匀，内孔体积及尺寸，耐碱性都满足要求的多孔聚合物基质微球。
[0010]该多孔微球合成可以使用传统的悬浮聚合，分散聚合，乳化悬浮聚合(使用高速乳化头制备分散均匀的预乳化液)，种子溶胀聚合(CN1038756C)，种子多步溶胀聚合 (CN101186661A)等。本专利技术实施例中就是使用了一种高速乳化设备，对反应液进行分散后获得尺寸分布均匀反应液液滴，然后进行聚合。为了获得多孔的，耐碱性强，机械强度高的微球，反应液中含有耐碱性的单体，交联剂，造孔剂，水相阻聚剂，以及稳定剂等。一般聚合时加入的引发剂多为油溶性的。
[0011]常见的合适单体一般为苯乙烯基的单体，可以是单官能度与多官能度的单体，多官能度单体如二乙烯基苯DVB，二乙烯基联苯等。这些多官能度单体可以单独使用或者两种及多种混合使用。为了获得优异的耐酸碱性，机械强度，优选二乙烯基苯DVB。除了多官能度的单体，也可添加适量的单官能度的单体，比如像苯乙烯和其衍生物。但配方中需要保证多官能度单体质量含量高于50wt％，优选大于60wt％，更优选大于70wt％。
[0012]一般成孔剂为脂肪族或芳香族烃，酯，酮，醚，醇类溶剂。含量为0
‑
200wt％的单体质量，可以单独或混合使用。多孔微球的内孔大小，形貌，尺寸分布可以通过控制成孔剂的含量与种类来优化。一般反应的溶剂为水，水实际上也可以作为成孔剂，成孔机理是：在单体中溶解一部分油溶性表面活性剂，然后吸水来实现成孔。这些油溶性表面活性剂包括：C16
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C24 枝化脂肪酸的脱水山梨醇单酯，C16
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C22线性不饱和脂肪酸的脱水山梨醇单酯，C12
‑
C14链段式饱和脂肪酸的脱水山梨醇单酯，山梨醇酐月桂酸酯(商标：SPAN20)，失水山梨醇油酸酯 (SAPN80)等。相对于单体质量，这些表面活性剂的使用量在5wt％
‑
80wt％。
[0013]聚合反应一般在水为介质的体系中进行，水中也可以含有一定量的共溶的有机溶剂比如乙醇。水中也可以含有表面活性剂，或者水溶性大分子稳定剂，或者一种或多种表面活性剂以及大分子稳定剂的混合物。表面活性剂一般是水中常用的非离子，阴离子，或双亲性表面活性剂。大分子水溶性聚合物优选聚乙烯醇或是羟乙基纤维素或类似物质。稳定剂可以单独使用或者混合使用，其含量一般按质量来算，应该是单体总量的0.3
‑
15wt％，优选1
‑
10wt％。
[0014]聚合的引发剂应该是油溶性，以防止在水中聚合形成小的颗粒，典型的代表有有机过氧化物比如过氧化苯甲酰，过氧化月桂酰等；偶氮类化合物比如偶氮二异丁腈等。其含量一般按质量来算，应该是单体总量的0.1
‑
7wt％，优选0.1
‑
5wt％。
[0015]为了防止形成小的颗粒，一般还需要在水中加入可溶性的阻聚剂，比如硝酸盐，硫酸盐，碘化盐，对苯二酚，维生素C，柠檬酸，多酚类物质等。其加入量一般要达到其在反应温度下水中的饱和溶解度。
[0016]聚合温度一般为25
‑
100℃，优选50
‑
100℃。
[0017]聚合得到的颗粒平均尺寸一般为10
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300微米，优选30
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100微米。粒径多分布系数一般小于1.3，优选小于1.2，更优选小于1.1。颗粒孔的体积分数优选30
‑
70％，更优选40
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70％。孔的平均尺寸优选100
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种亲水改性疏水聚合物基质Protein A亲和层析介质的制备方法，制备步骤包括：1)尺寸分布均匀，高度交联的疏水多孔聚合物微球的制备；2)用稀释的含有适度疏水改性的琼脂糖或葡聚糖或类似结构物质或两种及多种混合水溶液对步骤1中制备的多孔微球进行含浸，使步骤1的多孔微球表面和内孔表面都覆盖丰富的羟基；3)对改性后的多孔微球表面以及内孔表面覆盖的改性富含羟基成分进行交联反应；4)对表面交联后的多孔微球进行环氧官能团接枝反应；5)最后进行Protein A接枝反应。2.权力要求1中步骤1多孔疏水聚合物微球制备方法优选乳化悬浮聚合法：使用乳化机对聚合单体，稳定剂，造孔剂，阻聚剂在水中高效乳化制备稳定且粒径均一的预乳液，然后加入疏水型引发剂引发聚合后获得多孔聚合物微球。其中优选的单体以二乙烯基苯为主。3.权力要求2中二乙烯基苯含量优选大于50wt％。4.权利要求1中步骤2中优选的富含羟基物质为琼脂糖脂。5.权力要求1中步骤2中疏水性改性物质优选含有苯基和环氧基的化学物质，比如苯基...

【专利技术属性】
技术研发人员：马杰，
申请(专利权)人：马杰，
类型：发明
国别省市：