一株NADC34-like猪繁殖与呼吸综合征病毒反向遗传操作平台的构建与应用制造技术

本发明专利技术涉及一株NADC34

【技术实现步骤摘要】
一株NADC34
‑
like猪繁殖与呼吸综合征病毒反向遗传操作平台的构建与应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一株NADC34
‑
like猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆病毒以及基于该毒株编辑产生的一株具有Marc
‑
145细胞嗜性的改造病毒。

技术介绍

[0002]猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是严重危害我国养猪业健康发展的重要病原。PRRSV感染可引起母猪流产和仔猪呼吸系统综合征。最新研究将PRRSV分为两个种(species)：PRRSV1和PRRSV2。我国主要流行的是PRRSV2，其中以高致病性PRRSV2(HP
‑
PRRSV2)、NADC30
‑
like PRRSV2和NADC34
‑
like PRRSV2为主。其中，我国NADC34
‑
like PRRSV2毒株最早于2017年报道并迅速在全国各地传播流行。该毒株猪体适应性强，毒力变化大，给我国养猪业造成极大经济损失。
[0003]PRRSV是一种单股正链RNA病毒，属于动脉炎病毒科，其基因组大小约为15kb，包含10个开放阅读框(ORF)。ORF1a和ORF1b基因编码至少16个非结构蛋白，ORF2
‑
7基因编码8个结构蛋白。其中，ORF2
‑
4基因编码的三种小囊膜蛋白(GP2a，GP3和GP4)通过非共价键形成异三聚体，在PRRSV感染靶细胞中发挥关键作用。有研究表明GP2a，GP3和GP4是决定PRRSV细胞嗜性的关键蛋白。
[0004]疫苗免疫是防控我国PRRS疫情的主要手段。但现有商品化PRRS弱毒疫苗交叉保护效果差，且尚未研制出NADC34
‑
like PRRSV2毒株特异性的弱毒疫苗。此外，NADC34
‑
like PRRSV2分离株不具有Marc
‑
145细胞嗜性，是阻碍其特异性疫苗研制的重要障碍。
[0005]反向遗传操作技术已成为新型基因工程疫苗研制的重要手段。但是目前尚未有NADC34
‑
like PRRSV2反向遗传操作平台构建的报道，更没有基于NADC34
‑
like PRRSV2改造获得Marc
‑
145细胞嗜性病毒的报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术针对上述现有技术存在的问题，针对我国近年来出现并广泛流行的NADC34
‑
like PRRSV2毒株，本专利技术提供一株NADC34
‑
like PRRSV2感染性克隆病毒的构建方法，同时在其基础上获得了一株可适应Marc
‑
145细胞体外传代培养的NADC34
‑
like PRRSV2改造毒株。这一改造毒株可作为候选毒株用于研制我国首个NADC34
‑
like PRRSV2特异性疫苗。
[0007]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0008]一株NADC34
‑
like猪繁殖与呼吸综合征病毒，所述病毒为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)rBJ1805
‑
2；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为位于中国武汉的武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:V202250，保藏日期为2022.6.29。
[0009]一种用于构建NADC34
‑
like猪繁殖与呼吸综合征病毒反向遗传操作平台的重组载体，所述重组载体为pACYC177
‑
rBJ1805
‑
2，所述重组载体以pACY177质粒为载体，其中含有
NADC34
‑
like PRRSV2 BJ1805
‑
2分离株的全基因序列，所述全基因序列如SEQ ID NO:1所示。
[0010]一株NADC34
‑
like猪繁殖与呼吸综合征病毒的反向遗传操作平台的构建方法，所述的方法如下：
[0011]提取NADC34
‑
like PRRSV2分离株BJ1805
‑
2的RNA，使用反转录试剂盒将病毒RNA反转录为cDNA；以所述cDNA为模板，通过设计引物分段扩增的方法扩增NADC34
‑
like PRRSV2分离株BJ1805
‑
2全基因，再将扩增产生的各个片段分别进行测序，最后通过序列比对软件拼接获得NADC34
‑
like PRRSV2BJ1805
‑
2分离株的全基因序列；
[0012]以pACY177质粒为载体，利用PCR扩增、酶切连接方法将NADC34
‑
like PRRSV2 BJ1805
‑
2分离株的全基因序列分段连接到载体上，获得BJ1805
‑
2全长感染性克隆重组质粒；
[0013]然后通过感染性克隆的方法对所述NADC34
‑
like猪繁殖与呼吸综合征病毒进行拯救，所述拯救获得的病毒为NADC34
‑
like PRRSV2感染性克隆病毒rBJ1805
‑
2。
[0014]优选的，所述方法中，用于扩增NADC34
‑
like PRRSV2分离株BJ1805
‑
2全基因的引物组如下：
[0015][0016][0017]。
[0018]优选的，所述方法中，获得BJ1805
‑
2全长感染性克隆重组质粒的方法如下：
[0019](1)BJ1805
‑
2全基因片段分段扩增
[0020]BJ1805
‑
2全基因组被分为三个片段进行扩增；
[0021](2)BJ1805
‑
2各片段连接
[0022]使用产物纯化试剂盒纯化上述扩增产物，纯化产物与pACYC177质粒双酶切，依次连接到pACYC177载体，最终获得含全基因组序列的感染性克隆质粒pACYC177
‑
rBJ1805
‑
2。
[0023]优选的，所述步骤(1)BJ1805
‑
2全基因片段分段扩增中，在BJ1805
‑
2基因组的5
’
端引入PacI单酶切位点，3
’
端加入丁型肝炎病毒(HDV Ribozyme)序列，且采用如下引物组：
[0024][0025]优选的，所述步骤(1)BJ1805
‑
2全基因片段分段扩增中，采用如下方法：
[0026]首先，将引物BJ1805
‑2‑
PacI
‑
F1和BJ1805
‑2‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株NADC34
‑
like猪繁殖与呼吸综合征病毒，其特征在于，所述病毒为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)rBJ1805
‑
2；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为位于中国武汉的武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:V202250，保藏日期为2022.6.29。2.一种用于构建NADC34
‑
like猪繁殖与呼吸综合征病毒反向遗传操作平台的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pACYC177
‑
rBJ1805
‑
2，所述重组载体以pACY177质粒为载体，其中含有NADC34
‑
like PRRSV2 BJ1805
‑
2分离株的全基因序列，所述全基因序列如SEQ ID NO:1所示。3.根据权利要求1所述一株NADC34
‑
like猪繁殖与呼吸综合征病毒的反向遗传操作平台的构建方法，其特征在于，所述的方法如下：提取NADC34
‑
like PRRSV2分离株BJ1805
‑
2的RNA，使用反转录试剂盒将病毒RNA反转录为cDNA；以所述cDNA为模板，通过设计引物分段扩增的方法扩增NADC34
‑
like PRRSV2分离株BJ1805
‑
2全基因，再将扩增产生的各个片段分别进行测序，最后通过序列比对软件拼接获得NADC34
‑
like PRRSV2BJ1805
‑
2分离株的全基因序列；以pACY177质粒为载体，利用PCR扩增、酶切连接方法将NADC34
‑
like PRRSV2 BJ1805
‑
2分离株的全基因序列分段连接到载体上，获得BJ1805
‑
2全长感染性克隆重组质粒；然后通过感染性克隆的方法对所述NADC34
‑
like猪繁殖与呼吸综合征病毒进行拯救，所述拯救获得的病毒为NADC34
‑
like PRRSV2感染性克隆病毒rBJ1805
‑
2。4.根据权利要求3所述一株NADC34
‑
like猪繁殖与呼吸综合征病毒的反向遗传操作平台的构建方法，其特征在于，所述方法中，用于扩增NADC34
‑
like PRRSV2分离株BJ1805
‑
2全基因的引物组如下：
5.根据权利要求3所述一株NADC34
‑
like猪繁殖与呼吸综合征病毒的反向遗传操作平台的构建方法，其特征在于，所述方法中，获得BJ1805
‑
2全长感染性克隆重组质粒的方法如下：(1)BJ1805
‑
2全基因片段分段扩增BJ1805
‑
2全基因组被分为三个片段进行扩增；(2)BJ1805
‑
2各片段连接使用产物纯化试剂盒纯化上述扩增产物，纯化产物与pACYC177质粒双酶切，依次连接
到pACYC177载体，最终获得含全基因组序列的感染性克隆质粒pACYC177
‑
rBJ1805
‑
2。6.根据权利要求5所述一株NADC34
‑
like猪繁殖与呼吸综合征病毒的反向遗传操作平台的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)BJ1805
‑
2全基因片段分段扩增中，在BJ1805
‑
2基因组的5
’
端引入PacI单酶切位点，3
’
端加入丁型肝炎病毒(HDV Ribozyme)序列，且采用如下引物组：7.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈南华，邱明，朱建中，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：