一种基于荧光共振能量转移的人血清AFP-L3%检测试剂盒及其检测方法与应用技术

本发明专利技术公开了基于荧光共振能量转移的人血清AFP

【技术实现步骤摘要】
一种基于荧光共振能量转移的人血清AFP
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L3％检测试剂盒及其检测方法与应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种基于荧光共振能量转移的人血清AFP
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L3％检测试剂盒及其检测方法与应用。

技术介绍

[0002]肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上第六大常见癌症，每年大约有90万患者确诊。同时，肝癌也是全球第三大肿瘤致死成因，大约只有7％的晚期患者生存期超过5年。HCC患者早期临床症状并不明显，多数患者直到肝细胞癌的中晚期才被发现，导致患者错过最佳的治疗时间。因此，要改善疗效，提高患者生存率依赖于提高HCC的早期诊断率，这对于患者的预后也具有重要意义。
[0003]传统意义上，研究人员利用血清学生物标志物——甲胎蛋白(AFP)的总浓度检测肝癌，已经有研究表明，HCC患者血清中总AFP的浓度持续上升。但这种方法存在一定的局限性，敏感性弱、特异性低等，AFP在肝脏慢性疾病中(慢性肝炎、肝硬化等)也会有不同程度的升高，且并非所有HCC患者中AFP均会升高。最近的研究表明，不同的肝疾病患者所产生的AFP在糖链上有所区别，根据与扁豆凝集素(LCA)反应的亲和力，AFP存在三种分型，AFP
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L1、AFP
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L2与AFP
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L3，AFP
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L1主要来源于良型肝细胞，AFP
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L2来自孕妇，AFP
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L3则主要来源于癌变的肝细胞，对肝癌的特异性高达95％。美国食品药品监督管理局(FDA)已批准将AFP
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L3分析应用于HCC的预警。将AFP
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L3占AFP总含量的10％作为阳性临界值，超过该比值表明HCC的发病率超过95％。因此，AFP
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L3不仅可以用于HCC的早期诊断，还可以用于疾病预后的判断及复发监测。
[0004]目前AFP
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L3的常规检测方法有亲和免疫交叉电泳法、亲和印迹法、凝集素酶联免疫吸附试验法(lectin
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ELISA)等。这些方法有的已经应用于临床，有的还停留在科研阶段，但其检测的根本原理大都先将AFP
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L3与AFP分开后再进行测定，由于检测敏感性和重复性仍需进一步优化，同时检测成本较高，不适合市场大规模运用。基于临床研究和市场应用的需求，迫切需要开发一种可作为AFP
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L3定量检测的简便、快速、低成本的检测手段。
[0005]荧光共振能量转移(FRET)的原理是当供体分子的荧光光谱与受体分子的激发光谱部分重叠，并且两者之间的距离小于10nm时，供体分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体分子自身的荧光衰减。由于FRET具有高灵敏度、低背景和巨大的应用潜力，已经开发了几种基于FRET邻近连接的策略用于检测蛋白特异性糖基化，例如检测EGFR和MUC1的特异性糖型。目前，FRET策略还没有应用到AFP
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L3的检测，原因可能是识别AFP
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L3标志性核心岩藻糖的凝集素均为大分子蛋白，由于标记分子本身的尺寸过大，导致供受体之间的距离大于10nm，无法发生FRET作用。翘鳞环锈伞凝集素(PhoSL)是一种新型凝集素，分子量小，且对核心岩藻糖有良好的特异性识别能力，此外，它在宽范围的pH和温度下高度稳定，并且在各种缓冲液中高度可溶。这些优势均表明PhoSL有望成为分析AFP
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L3的有力工具，并在不久的将来成为诊断试剂。

技术实现思路

[0006]专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种基于荧光共振能量转移的人血清AFP
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L3％检测试剂盒，该试剂盒具有样本损耗量小、检测快速、灵敏度高、选择性良好等优点，可提高肝细胞癌的早期检出率。
[0007]本专利技术还提供基于荧光共振能量转移的人血清AFP
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L3％试剂盒的检测方法及其应用。
[0008]技术方案：为了实现上述目的，本专利技术所述一种基于荧光共振能量转移的人血清AFP
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L3％检测试剂盒，包括磁珠试剂、核酸适配体试剂、互补DNA试剂、凝集素试剂、AFP标准品、AFP
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L3标准品、缓冲溶液I以及缓冲溶液II。
[0009]进一步地，所述磁珠试剂为链霉亲和素修饰的磁性微珠溶液，磁珠尺寸在0.1
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10μm之间，磁珠溶液浓度为5
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10mg/mL。
[0010]作为优选，磁珠尺寸为1μm。
[0011]进一步地，所述核酸适配体试剂为荧光探针标记的可特异性识别甲胎蛋白AFP的寡聚核苷酸链溶液，浓度为10
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100μM，所述核酸适配体序列如SEQ ID NO.1所示。
[0012]进一步地，所述互补DNA试剂为生物素修饰的与核酸适配体互补的寡聚核苷酸链溶液，浓度为10
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100μM，所述互补的DNA序列如SEQ ID NO.2
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SEQ ID NO.6任意所示。
[0013]作为优选，所述互补DNA试剂为生物素修饰的与核酸适配体互补的寡聚核苷酸链溶液，浓度为10μM，所述互补的DNA序列如SEQ ID NO.5所示。
[0014]进一步地，所述凝集素试剂为荧光猝灭剂修饰的新型凝集素PhoSL
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Dabcyl溶液，浓度为200
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800ng/mL。
[0015]进一步地，标记核酸适配体的荧光探针需与标记凝集素的荧光猝灭剂匹配，荧光探针
‑
荧光猝灭剂为FAM
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BHQ1或FAM
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Dabcyl或Cy3
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BHQ2或Cy5
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BHQ3任意一种。
[0016]进一步地，所述AFP标准品为AFP
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L1与AFP
‑
L3等浓度混合溶液，其总浓度为100
‑
300ng/mL，所述AFP
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L3标准品为AFP
‑
L1与AFP
‑
L3不同浓度比例混合溶液，其总浓度为5
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10ng/mL，AFP
‑
L3占比0
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50％。
[0017]作为优选，所述AFP标准品为AFP
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L1与AFP
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L3浓度1:1混合溶液，其总浓度为200ng/mL，所述AFP
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L3标准品为AFP
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L1与AFP
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L3不同浓度比例混合溶液，其总浓度为8ng/mL，AFP
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L3占比0
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50％。
[0018]进一步地，所述缓冲溶液I组分为10
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于荧光共振能量转移的人血清AFP
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L3％检测试剂盒，其特征在于，包括磁珠试剂、核酸适配体试剂、互补DNA试剂、凝集素试剂、AFP标准品、AFP
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L3标准品、缓冲溶液I和缓冲溶液II。2.根据权利要求1所述的基于荧光共振能量转移的人血清AFP
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L3％检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠试剂为链霉亲和素修饰的磁性微珠溶液，磁珠尺寸在0.1
‑
10μm之间，磁珠溶液浓度为5
‑
10mg/mL。3.根据权利要求1所述的基于荧光共振能量转移的人血清AFP
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L3％检测试剂盒，其特征在于，所述核酸适配体试剂为荧光探针标记的可特异性识别甲胎蛋白AFP的寡聚核苷酸链溶液，浓度为10
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100μM，所述核酸适配体序列如SEQ ID NO.1所示。4.根据权利要求1所述的基于荧光共振能量转移的人血清AFP
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L3％检测试剂盒，其特征在于，所述互补DNA试剂为生物素修饰的与核酸适配体互补的寡聚核苷酸链溶液，浓度为10
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100μM，所述互补DNA序列如SEQ ID NO.2
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SEQ ID NO.6任意所示。5.根据权利要求1所述的基于荧光共振能量转移的人血清AFP
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L3％检测试剂盒，其特征在于，所述凝集素试剂为荧光猝灭剂修饰的新型凝集素PhoSL
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Dabcyl溶液，浓度为200
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800ng/mL。6.根据权利要求1所述的基于荧光共振能量转移的人血清AFP
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L3％检测试剂盒，其特征在于，标记核酸适配体试剂的荧光探针需与标记凝集素的荧光猝灭剂匹配，荧光探针
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荧光猝灭剂为FAM
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BHQ1、FAM
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Dabcyl、Cy3
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BHQ2或Cy5
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BHQ3任意一种。7.根据权利要求1所述的基于荧光共振能量转移的人血清AFP
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L3％检测试剂盒，其特征在于，所述AFP标准品为AFP
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L1与AFP
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L3等浓度混合溶液，其总浓度为100
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300ng/mL，所述AFP
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L3标准品为AFP
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L1与AFP
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L3不同浓度比例混合溶液，其总浓度为5
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10ng/mL，AFP
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L3占比0
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50％。8.根据权利要求1所述的基于荧光共振能量转移的人血清AFP
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L3％检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲溶液I组分为10

【专利技术属性】
技术研发人员：刘松琴，刘雨，华鑫，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：