与GDF15特异性结合的适配体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药工程技术领域，与GDF15特异性结合的适配体，其序列通式为：5

【技术实现步骤摘要】
与GDF15特异性结合的适配体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药工程
，涉及眼科生物医药工程
，具体涉及一种与生长分化因子15(GDF15)特异性结合的适配体及其应用。

技术介绍

[0002]青光眼是一组以视乳头萎缩及凹陷、视野缺损及视力下降为共同特征的神经退行性疾病。据统计，2020年全球约有8000万青光眼患者，青光眼具有发病隐匿，早期诊断困难，视功能损害不可逆等特性。青光眼的早筛查、早诊断和早干预可以有效阻断或者延缓病情进展，从而能够保护患者免受严重的视力丧失。
[0003]目前，青光眼诊断主要通过眼压测量、形态学及功能学检查进行综合评估。但眼内压在患者与患者之间存在巨大差异，而形态学和功能学检查往往是在患者的视觉功能损害达到50％以上才能准确诊断。因此，青光眼的早期诊断一直都是该领域研究的热点和难点。生长分化因子15(growth differentiation factor 15,GDF15)是一种与青光眼视神经损伤相关的特征性生物标志物。大量研究已证实，眼内液中GDF15的水平与青光眼的发生发展具有显著的剂量依赖关系。通过精准监测GDF15，将会为青光眼的筛查、诊断和干预提供帮助。
[0004]目前亟需解决的问题是获得一种特异性识别GDF15的分子工具。适配体作为一种新型的生物识别分子，能够特异识别并高亲和力的结合靶标。它通常是利用体外筛选技术—指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution ofligands by exponential enrichment,SELEX)，从随机核酸文库中获得的ssDNA或RNA分子。适配体由于可化学合成、易于标记和修饰、免疫原性和毒性低、亲和力高、特异性强等优势，可用于特定靶标的捕获、检测和成像，以及相应的治疗药物的研发和靶向给药系统的构建等，在分析、诊断和医药等多个领域中具有广阔的应用前景。

技术实现思路

[0005]本专利技术是为解决上述技术问题进行的，目的在于提供一种与GDF15特异性结合的适配体及其应用。
[0006]本专利技术的目的在于提供多条能够与GDF15高亲和力、强特异性结合的单链DNA适配体。首先筛选得到适配体APT1和APT2，并对该两条适配体与GDF15之间的亲和力进行测试，得到亲和力常数(K
D
)值最低的一条适配体APT2。
[0007]本专利技术的第二目的在于以截短的方式对适配体APT2进行优化，提供结合能力更优，但是长度更短的GDF15适配体APT2T。它不但保持对GDF15高的识别特异性，而且结合亲和力由原来的9.2nM增加至1.07nM。
[0008]本专利技术的第三目的在于对适配体APT2T继续进行优化。为了进一步提高适配体的结构稳定性，我们对APT2T进行了定点突变，获得了适配体APT2TM。与APT2T相比，APT2TM不仅折叠成了更高稳定性的G
‑
四聚体结构，而且它保持了对GDF15一致的结合强度和特异性。
[0009]本专利技术的第四目的在于提供适配体的应用，如适配体在制备GDF15分离富集试剂中的应用，在制备GDF15检测试剂、试剂盒或传感器中的应用，在制备诊断、缓解或治疗GDF15介导的疾病药物中的应用，如青光眼的早期筛查和快速诊断以及治疗。
[0010]为了实现上述目的，本专利技术的主要技术方案是：(1)通过磁珠SELEX技术筛选，获得了靶向GDF15的高特异性适配体APT1和APT2；(2)通过截短优化，得到了靶向GDF15的高特异性、高亲和力适配体APT2；(3)通过突变优化，得到了靶向GDF15的高特异性、高亲和力和高稳定性适配体APT2TM。具体技术方案如下：
[0011]本专利技术的第一方面，提供了与GDF15特异性结合的适配体，该适配体的序列通式为：5
’‑
AGCAGCACAGAGGTCAGATG
‑
N
40
‑
CCTATGCGTGCTACCGTGAA
‑3’
；其中，N为A、T、G、C四种脱氧核糖核苷酸碱基中的任意一个，40代表随机碱基的数量。
[0012]通过磁珠
‑
SELEX技术筛选，得到如下代表性序列：
[0013]APT1：ACTAGGTCAGGATACTGTTGCGCACGCCCAGAGTTATCTA(SEQ IDNO.1)；
[0014]APT2：TGAGGCGAGTAGGATAGGGTATGGGATGGGTTCGTTGCAC(SEQ IDNO.2)。
[0015]本专利技术的第二方面，以截短的方式对适配体APT2进行优化，提供结合能力更优，但是长度更短的适配体APT2T：GGATAGGGTATGGGATGGG(SEQ ID NO.3)。
[0016]本专利技术的第三方面，对适配体APT2进行突变优化，获得了适配体APT2TM：GGGTAGGGTATGGGATGGG(SEQ ID NO.4)。与APT2T相比，APT2TM不仅折叠成了更高稳定性的G
‑
四聚体结构，而且它保持了对GDF15一致的结合强度和特异性。
[0017]优选的，上述适配体APT2TM或APT2T或APT2，可以在其3
’
端或5
’
端进行生物素、FITC和巯基等化学修饰。
[0018]本专利技术的第四方面，提供了适配体的应用，选自如下任一种情形：
[0019](1)提供上述适配体在制备GDF15检测试剂、试剂盒或传感器中的应用；
[0020](2)提供上述适配体在制备GDF15捕获、分离和纯化制剂中的应用。
[0021](3)提供上述适配体在开发致盲性眼病诊断新方法中的应用。所述的诊断新方法是基于上述适配体对GDF15的结合作用，可用于青光眼的早期筛查和快速诊断。
[0022](4)提供上述适配体在构建靶向给药系统中的应用。所述的靶向给药系统是基于上述适配体对GDF15的识别作用，可用于药物的靶向运输和定点释放。
[0023](5)还提供了上述适配体在制备核酸药物中的应用。该药物是基于上述适配体对GDF15的中和或阻断作用，可用于缓解或者治疗GDF15所介导的相关疾病。
[0024]本专利技术的第五方面，提供了一种与GDF15特异性结合的适配体的药物组合物，以与GDF15特异性结合的适配体作为活性成份，还包括医学上可接受的药物载体。
[0025]优选的，药物组合物为青光眼的早期筛查和快速诊断的制剂。
[0026]本专利技术的药物组合物和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物，从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本专利技术公开的适配体核心序列的构像完整性，同时还能保护蛋白质的多官能团，防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。
[0027]本专利技术的有益保障及效果：
[0028]1.本专利技术将GDF15固定在磁珠表面，通过磁珠SELEX技术的筛选，获得了一组高特异性识别G本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.与GDF15特异性结合的适配体，其特征在于，所述适配体的序列通式为：5
’‑
AGCAGCACAGAGGTCAGATG
‑
N
40
‑
CCTATGCGTGCTACCGTGAA
‑3’
；其中，N为A、T、G、C四种脱氧核糖核苷酸碱基中的任意一个，40代表随机碱基的数量。2.根据权利要求1所述的与GDF15特异性结合的适配体，其特征在于：其中，所述适配体的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2中任一条所示。3.根据权利要求1所述的与GDF15特异性结合的适配体，其特征在于：其中，所述适配体的序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4中任一条所示。4.权利要求1～3任一项所述的与GDF15特异性结合的适配体在制备GDF15捕获、分离、纯化制剂或构建GDF15靶向给药系统中的应用。...

【专利技术属性】
技术研发人员：高顺祥，李倩，吴继红，孙兴怀，张圣海，
申请(专利权)人：复旦大学附属眼耳鼻喉科医院，
类型：发明
国别省市：