一种可视化误导细胞内唾液酸化的介孔硅探针及制备方法技术

本发明专利技术涉及一种用于可视化误导细胞内唾液酸化的介孔硅探针。它以介孔二氧化硅纳米粒子为载体，表面同时修饰了半乳糖，叶酸和修饰有被黑洞猝灭剂1(BHQ1)猝灭的羧基荧光素(FAM)的功能双链DNA分子，内部装载有两端分别有苯硼酸和花菁5荧光素(Cy5)的功能单链DNA分子。当介孔硅探针通过其表面的叶酸介导的细胞内吞进入细胞内后，细胞内的唾液酸转移酶会以介孔硅探针表面的半乳糖为基底在连接上唾液酸，从介孔硅内部释放出来的功能单链DNA分子一端的Cy5的荧光用于示踪，另一端的苯硼酸会与连接的唾液酸特异性结合，并引发邻位链取代作用取代下功能双链DNA分子中修饰有BHQ1的单链，恢复FAM的荧光，实现细胞内唾液酸化的可视化误导。化误导。化误导。

【技术实现步骤摘要】
一种可视化误导细胞内唾液酸化的介孔硅探针及制备方法
一、

[0001]本专利技术涉及一种用于可视化误导细胞内唾液酸化的介孔硅探针及其制备方法。
二、
技术介绍

[0002]唾液酸是一种重要的生物分子，它通常位于细胞表面糖蛋白或者糖脂分子的末端，介导了大量的生理和病理过程，并且在肿瘤细胞的免疫调控过程中起着重要的作用。唾液酸一般是由细胞内唾液酸转移酶介导的唾液酸化过程产生的。对肿瘤细胞内的唾液酸化过程进行误导可以直接降低细胞表面唾液酸的表达，进一步抑制肿瘤的免疫逃逸，促进对肿瘤细胞的免疫治疗效果。
[0003]为了实现对细胞表面唾液酸的调控进而用于肿瘤抑制，该专利制备了一种介孔硅探针，建立了对细胞内唾液酸化过程误导并且可视化监测的分析方法。
三、
技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是：将介孔硅纳米粒子氨基硅烷化，在其表面共价连接三种不同功能的聚乙二醇分子，再在其中一种功能聚乙二醇分子末端连接功能双链DNA分子，最后在介孔硅纳米粒子内部装载功能单链DNA分子，制得一种介孔硅探针(图1)。检测方案通过将介孔硅探针直接与细胞孵育，利用介孔硅探针表面修饰的叶酸基团介导细胞内吞(图2)；细胞内唾液酸转移酶会以介孔硅探针表面修饰的半乳糖基团为基底，在其上连接上唾液酸分子，实现细胞内唾液酸化的误导；介孔硅探针内部的功能单链DNA分子会从介孔硅探针的孔中释放出来，利用其一端花菁5荧光素(FAM)进行示踪，另一端的苯硼酸分子与唾液酸分子特异性结合；结合在介孔硅探针表面的功能单链DNA分子会通过邻位链取代作用取代结合在介孔硅探针表面的功能双链DNA分子中含有黑洞猝灭剂1(BHQ1)的单链，恢复含有羧基荧光素的单链的荧光，实现对细胞内唾液酸化误导过程的可视化。
[0005]本专利技术通过以下技术方案来实现：
[0006]以羟基化的介孔硅纳米粒子为载体，在氨基硅烷化后同时共价修饰三种不同的功能聚乙二醇分子，其一端均为琥珀酰亚胺基团，另一端分别是半乳糖基团，琥珀酰亚胺基团和叶酸基团；然后在另一端为琥珀酰亚胺基团的聚乙二醇分子末端进一步连接同一端的两条单链分别修饰有FAM和BHQ1的功能双链DNA分子；在介孔硅内部装载一端修饰有苯硼酸分子，另一端修饰有花菁5荧光素(Cy5)的功能单链DNA分子，即可得到介孔硅探针(图1)。
[0007]本专利技术的工作原理：
[0008]本专利技术提出的对细胞内细胞内唾液酸化可视化误导的介孔硅探针制备流程如图1所示。以羟基化的介孔硅纳米粒子为载体，在氨基硅烷化后同时共价修饰三种不同的功能聚乙二醇分子，其一端均为琥珀酰亚胺基团，另一端分别是半乳糖基团，琥珀酰亚胺基团和叶酸基团；然后在另一端为琥珀酰亚胺基团的聚乙二醇分子末端进一步连接同一端的两条单链分别修饰有FAM和BHQ1的功能双链DNA分子；在介孔硅内部装载一端修饰有苯硼酸分子，另一端修饰有Cy5的功能单链DNA分子，即可得到介孔硅探针。
[0009]本专利技术的工作原理如图2所示。将介孔硅探针直接与细胞孵育，利用介孔硅探针表面修饰的叶酸基团介导细胞的内吞；细胞内唾液酸转移酶会以介孔硅探针表面修饰的半乳糖基团为基底，在其上连接上唾液酸分子；介孔硅探针内部的功能单链DNA分子会从介孔硅探针孔中释放出来，利用其一端Cy5进行示踪，另一端的苯硼酸分子与唾液酸分子特异性结合；结合在介孔硅表面的功能单链DNA分子会通过邻位链取代作用取代结合在介孔硅表面的功能双链DNA分子中含有BHQ1的单链，恢复含有FAM的单链的荧光，实现对细胞内唾液酸化的可视化误导。
[0010]与现有技术相比，本专利技术具有以下特点：
[0011]本专利技术制备的介孔硅探针可以实现对细胞内唾液酸化的误导和可视化监测。
[0012]与已有的细胞内糖基化过程监测方法相比，本专利技术具备以下优点：
[0013]1.本专利技术所述的介孔硅探针为信号响应型，具有较低的荧光背景，可以实现细胞内唾液酸化误导过程的实时监测。
[0014]2.本专利技术所述的介孔硅探针可以实现肿瘤细胞内唾液酸化的误导，能够抑制细胞表面唾液酸的表达，促进肿瘤的免疫治疗。
四、附图说明
[0015]图1.介孔硅探针制备示意图
[0016]图2.用介孔硅探针可视化误导细胞内唾液酸化的过程
五、具体实施方式
[0017]实施例1：结合图1，制备合成可视化误导细胞内唾液酸化的介孔硅探针
[0018]将0.5克介孔硅纳米粒子(粒径80纳米)首先用10毫升食人鱼酸(含7毫升浓硫酸和3毫升30％过氧化氢)在室温下搅拌过夜。得到的羟基化介孔硅纳米粒子在洗涤烘干后，加入10毫升含1％氨基硅烷化试剂的无水乙醇，在36摄氏度下搅拌过夜。用乙醇和水各洗三次后将得到的氨基化介孔硅纳米粒子分散到三乙二胺四乙酸缓冲液中(pH 8.0)。将氨基化的介孔硅纳米粒子(10nM终浓度)与一端均为琥珀酰亚胺基团，另一端分别是半乳糖基团，琥珀酰亚胺基团和叶酸基团三种不同的功能聚乙二醇分子(50μM终浓度)在2毫升Tris
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EDTA缓冲液中(pH 8.0)室温下搅拌过夜。用三乙二胺四乙酸缓冲液离心洗涤三次后，将得到的聚乙二醇修饰的介孔硅纳米粒子(10nM终浓度)与一端的两条单链分别修饰有FAM和BHQ1的功能双链DNA分子的功能双链DNA分子(5μM终浓度)在2毫升三乙二胺四乙酸缓冲液中(pH 8.0)室温下搅拌过夜。用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)离心洗涤三次后，将得到双链DNA和聚乙二醇修饰的介孔硅纳米粒子(10nM终浓度)与一端修饰有苯硼酸分子，另一端修饰有Cy5的功能单链DNA分子(100μM终浓度)在0.5毫升磷酸盐缓冲液中(pH 7.4)室温下搅拌过夜，即得到介孔硅探针。
[0019]实施例2：结合图2，利用介孔硅探针可视化误导细胞内唾液酸化
[0020]将约10000个MCF
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7细胞接种在10毫米单孔共聚焦皿中孵育过夜，用PBS缓冲液洗涤三次。加入100μL分散于磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的介孔硅探针(5nM)，37摄氏度下在细胞培养箱中孵育4小时。随后直接利用共聚焦显微镜进行荧光成像，检测细胞内的FAM和Cy5的荧光。Cy5的荧光用于示踪介孔硅探针，FAM的荧光用于可视化细胞内唾液酸化的误导过程。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可视化误导细胞内唾液酸化的介孔硅探针，其特征在于，所述的介孔硅探针以介孔硅纳米粒子为载体，在其表面先修饰三种不同的功能聚乙二醇分子，再在其中一种功能聚乙二醇分子末端连接功能双链DNA分子，最后在介孔硅纳米粒子内部装载功能单链DNA分子制得；所述的修饰三种不同的功能聚乙二醇分子是先将介孔硅二氧化硅纳米粒子表面氨基硅烷化，然后共价修饰一端为琥珀酰亚胺基团，另一端分别是半乳糖基团，琥珀酰亚胺基团和叶酸基团的三种聚乙二醇分子；所述的连接功能双链DNA分子，其一端的两条单链末端分别修饰有羧基荧光素和黑洞猝灭剂1，另外一端通过修饰的氨基和介孔硅表面两端均为琥珀酰亚胺基团的聚乙二醇分子共价连接；所述的功能单链DNA分子，其一端修...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈云龙，鞠熀先，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：