家蚕羧肽酶抑制剂有效肽段和家蚕羧肽酶抑制剂及其应用制造技术

本发明专利技术公开了家蚕羧肽酶抑制剂有效肽段和家蚕羧肽酶抑制剂及其应用，家蚕羧肽酶抑制剂有效肽段的氨基酸序列为酪氨酸

【技术实现步骤摘要】
家蚕羧肽酶抑制剂有效肽段和家蚕羧肽酶抑制剂及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及家蚕羧肽酶抑制剂有效肽段、家蚕羧肽酶抑制剂，还涉及家蚕羧肽酶抑制剂有效肽段和家蚕羧肽酶抑制剂在治疗胃癌中的应用。

技术介绍

[0002]胃癌为起源于胃黏膜上皮的常见恶性肿瘤，威胁全人类健康与生命。早期胃癌在经治疗后预后较好，而晚期胃癌预后则较差。在胃癌治疗时，通常伴随患者的是化疗药物高毒副作用所带来的痛苦。已有研究表明多种昆虫中含有的抗菌肽，斑蝥素等生物活性物质能够发挥抗癌功能，而且相较于化疗药物，这类生物活性物质成药后毒副作用更小。
[0003]家蚕作为一种模式生物，在全基因组测序完成后越来越多基因的功能被研究，但是具有药用功效基因少见报道，因此挖掘家蚕来源物质的抗肿瘤药物对家蚕开发具有重要意义。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种家蚕羧肽酶抑制剂有效肽段；本专利技术的目的之二在于提供所述家蚕羧肽酶抑制剂有效肽段在制备治疗胃癌的药物中的应用；本专利技术的目的之三在于提供含有所述家蚕羧肽酶抑制剂有效肽段的多肽；本专利技术的目的之四在于提供所述多肽在制备治疗胃癌的药物中的应用；本专利技术的目的之五在于提供所述家蚕羧肽酶抑制剂在制备胃癌相关因子表达抑制剂中的应用。
[0005]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]1、家蚕羧肽酶抑制剂有效肽段，所述家蚕羧肽酶抑制剂有效肽段的氨基酸序列如下：酪氨酸
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甘氨酸
>‑
缬氨酸
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丝氨酸。
[0007]2、所述家蚕羧肽酶抑制剂有效肽段在制备治疗胃癌的药物中的应用。
[0008]本专利技术优选的，所述药物能够抑制胃癌细胞增殖。
[0009]3、含有所述家蚕羧肽酶抑制剂有效肽段的多肽。
[0010]本专利技术优选的，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]4、所述多肽在制备治疗胃癌的药物中的应用。
[0012]本专利技术优选的，所述胃癌为分化或未分化胃癌细胞。
[0013]本专利技术优选的，所述胃癌为MKN45细胞、SGC7901细胞或HGC27细胞。
[0014]本专利技术优选的，所述治疗胃癌为抑制胃癌细胞增殖。
[0015]5、所述家蚕羧肽酶抑制剂在制备胃癌相关因子表达抑制剂中的应用，所述胃癌相关因子为编码SH结构域基因、生长因子受体结合蛋白2、鸟苷酸交换因子、Raf蛋白、c
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Myc蛋白或周期蛋白CDK2，CDK4，Cyclin D1和Cyclin E1。
[0016]本专利技术的有益效果在于：本专利技术公开了构建了家蚕羧肽酶抑制剂基因重组表达载体，并获得重组蛋白。该重组蛋白能够显著抑制MKN45和SGC7901两株胃癌细胞系的增殖，在第三天时，10微克每毫升的家蚕羧肽酶抑制剂添加组对于胃癌细胞的抑制率能够达到
25％。通过检测影响胃癌细胞增殖的相关通路蛋白，发现部分胃癌细胞能够通过自磷酸化激活下游蛋白如MAPK/ERK通路相关蛋白而快速增殖，而在加入家蚕羧肽酶抑制剂进行培养后，由EGF/EGFR启动的MAPK/ERK通路促进原癌基因c
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Myc表达这一通路受到抑制，进而影响相关细胞周期蛋白表达，抑制胃癌细胞增殖。随后通过对家蚕羧肽酶抑制剂和表皮生长因子受体进行分子对接和虚拟筛选，我们筛选到一条与既有小分子抑制剂在受体中作用位置重叠的多肽。合成多肽后，对其进行抑制胃癌细胞增殖活性测定，发现其具有抑制胃癌细胞增殖的能力，因此该多肽为家蚕羧肽酶抑制剂有效肽段，也能作为胃癌的候选药物，为胃癌的治疗提供了新的药物，为昆虫来源物质抗肿瘤药物的开发提供了可能性。
附图说明
[0017]为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：
[0018]图1为家蚕羧肽酶抑制剂重组蛋白的原核表达和分离纯化结果；
[0019]图2为重组家蚕羧肽酶抑制剂抑制活性测定；
[0020]图3为重组家蚕羧肽酶抑制剂热稳定性和酸碱稳定性测定；
[0021]图4为家蚕羧肽酶抑制剂处理后胃癌细胞观察；
[0022]图5为MKN45和SGC7901细胞系发生酪氨酸自磷酸化；
[0023]图6为MAPK/ERK通路上游相关蛋白表达检测；
[0024]图7为家蚕羧肽酶抑制剂影响c
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Myc及其相关周期蛋白表达；
[0025]图8家蚕羧肽酶抑制剂肽段与小分子抑制剂tak
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285作用位置重叠；
[0026]图9家蚕羧肽酶抑制剂有效多肽抑制胃癌细胞增殖和克隆形成。
具体实施方式
[0027]下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0028]优选实施例中使用的胃癌细胞株SGC7901和MKN45购买于美国标准菌种收藏中心(the American Type Culture Collection，ATCC)；人肾胚永生化细胞293FT购买于Life Technologies公司。细胞均由西南大学前沿交叉学科研究院生物学研究中心传代保存。
[0029]实施例1、家蚕羧肽酶抑制剂重组蛋白的表达
[0030]对家蚕羧肽酶抑制剂进行了原核表达，用pet28a为载体成功表达了羧肽酶抑制剂，具体方法是将如SEQ ID NO.1所示的家蚕羧肽酶抑制剂基因CDS去除信号肽的序列连入pet28a的BamHI和XhoI酶切位点处，获得重组原核表达载体。将获得的重组表达载体转化BL21感受态中，获得工程菌。将得到的工程菌进行诱导表达，加入0.5mM IPTG后置于37℃摇床中4小时，诱导表达后收集上清，随后利用咪唑梯度进行洗脱，在100mM和200mM咪唑洗脱下得到了较纯蛋白，结果如图1所示，即为家蚕羧肽酶抑制剂重组蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0031]将获得的家蚕羧肽酶抑制剂重组蛋白用于制备抗体，并进行验证，条带单一特异性好，可用于后期实验。为了了解家蚕羧肽酶抑制剂在组织中表达情况，我们用五龄三天家
蚕各组织为模板，进行荧光定量PCR，发现其在丝腺高量表达，同时利用获得抗体进行Western blot，在蛋白水平上验证了这一结果，家蚕羧肽酶抑制剂在丝腺特异表达。
[0032]实施例2、家蚕羧肽酶抑制剂的活性评价
[0033]为了了解重组家蚕羧肽酶抑制剂是否有活性，对其进行了羧肽酶活性抑制实验。以土豆羧肽酶为底物，设置PBS阴性对照组，土豆羧肽酶抑制剂阳性对照组以及实验组。结果如图2所示。结果显示，重组家蚕羧肽酶抑制剂与土豆羧肽酶抑制剂对羧肽酶具有同样的抑制活性。
[0034]为了测定家蚕羧肽酶抑制剂的抑制稳定性，将家蚕羧肽酶抑制剂分别本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.家蚕羧肽酶抑制剂有效肽段，其特征在于：所述家蚕羧肽酶抑制剂有效肽段的氨基酸序列如下：酪氨酸
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甘氨酸
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缬氨酸
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丝氨酸。2.权利要求1所述家蚕羧肽酶抑制剂有效肽段在制备治疗胃癌的药物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，所述药物能够抑制胃癌细胞增殖。4.含有权利要求1所述家蚕羧肽酶抑制剂有效肽段的多肽。5.根据权利要求4所述的多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。6.权利要求4或5所述多肽在制备治疗胃癌的药物中的应用。7.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵萍，叶俊宏，夏庆友，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：