一种十足目虹彩病毒1的单域抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了十足目虹彩病毒1的单域抗体及其制备方法和应用；所述单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示，基因序列如SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4所示；同时本发明专利技术还提供一种十足目虹彩病毒1的单域抗体的制备方法，以成年健康的条纹斑竹鲨作为免疫对象，采用DIV1为抗原进行免疫；通过分离免疫条纹斑竹鲨外周血淋巴细胞，提取总RNA，再反转录为cDNA；以cDNA为模板，扩增条纹斑竹鲨vNAR片段，与载体连接构建噬菌体文库；从噬菌体文库中淘选识别DIV1的阳性克隆；构建表达载体，诱导表达DIV1单域抗体，最终获得十足目虹彩病毒1的单域抗体；本发明专利技术还将十足目虹彩病毒1的单域抗体用于检测十足目虹彩病毒1。抗体用于检测十足目虹彩病毒1。抗体用于检测十足目虹彩病毒1。

【技术实现步骤摘要】
一种十足目虹彩病毒1的单域抗体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于分子免疫学和病原生物学交叉
，具体涉及一种十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1，DIV1)的单域抗体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]虾虹彩病毒病是一种急性、传染性疾病，其病原为虹彩病毒科的一个新属即十足目虹彩病毒属的十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1，DIV1)。DIV1是一种具有线性双链DNA的胞浆型病毒，病毒在斜射光的照射下会出现虹彩现象，因而被称为虹彩病毒。DIV1对于甲壳动物的致死率可高达100％。对虾感染DIV1后变现为肝胰腺颜色变浅、空肠空胃和甲壳变软，可在短期内引起大面积死亡。近年来，十足目虹彩病毒病在我国多数沿海虾养殖区均有爆发，危害波及凡纳滨对虾、中国明对虾、脊尾白虾、日本沼虾和罗氏沼虾等众多品种，每年造成经济损失达数亿美元，严重危害虾类养殖产业健康发展。
[0003]目前，针对十足目虹彩病毒1尚无有效的防治措施，实现该病的早期诊断是亟待解决的问题。现有鉴定DIV1感染的方法主要有PCR检测和原位杂交；公开号为CN114717358A的中国专利公开了“一种用于同时检测虾肝肠胞虫、十足目虹彩病毒1的双重PCR检测方法及试剂盒”，其中具体公开的检测方法对检测的病原基因片段无需再进行克隆、测序和序列比对，一次实验即可检测出待测样品中是否含有这2种病原中的一种或两种；公开号为CN111218530A的中国专利公开了“荧光定量PCR检测十足目虹彩病毒1的引物组及试剂盒”，其中具体公开了根据DIV1的MCP基因保守序列设计特异性的引物及TaqMan
‑
MGB探针和试剂盒，制备了重组质粒标准品pMD18
‑
T
‑
MCPDIV1，建立了检测DIV1的TaqMan
‑
MGB探针荧光定量PCR方法。但是上述分子生物学检测方法对技术要求较高，依赖于基层实验室的建立，难以实现“池边检测”，因而难以在养殖生产中推广应用。
[0004]研制病毒的单克隆抗体，利用免疫学检测技术开发现场检测产品是实现十足目虹彩病毒1早期诊断的有效途径。近年来，免疫学检测在虾病原检测方面进展较大，已实现数种虾重大病害的早期检测，如白斑综合征、急性肝胰腺坏死病等。目前，尚无虾虹彩病毒DIV1单克隆抗体研制的报道。

技术实现思路

[0005]为满足“池边检测”的养殖需求，解决现有技术中的十足目虹彩病毒1检测复杂的问题，本专利技术创造性地提出一种十足目虹彩病毒1的单域抗体及其制备方法和应用，通过本专利技术制备得到的单域抗体能够特异性地识别DIV1病毒，具有很好的灵敏度和准确性，为建立虾虹彩病毒病的早期诊断技术以及防治药物的研究提供新的思路。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]本专利技术提供一种十足目虹彩病毒1的单域抗体，所述单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
[0008]进一步的，所述单域抗体的基因序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
[0009]本专利技术还提供一种十足目虹彩病毒1的单域抗体的制备方法，具体包括以下步骤：
[0010](1)以成年健康的条纹斑竹鲨作为免疫对象，采用DIV1为抗原进行免疫；
[0011](2)完成免疫后，分离免疫鲨鱼外周血淋巴细胞，提取总RNA，反转录为cDNA；以cDNA为模板，扩增条纹斑竹鲨vNAR片段，将vNAR基因片段与载体进行酶接后构建噬菌体文库；
[0012](3)利用噬菌体展示技术，从文库中淘选识别DIV1的阳性克隆：通过对噬菌体文库进行淘筛、富集和鉴定，获得2株单域抗体，命名为十足目虹彩病毒1的单域抗体D02和D13；通过测序，获得D02和D13抗体的基因序列；
[0013](4)构建表达载体，诱导表达DIV1单域抗体：将D02和D13的基因序列克隆到PET30a上，获得表达载体，将表达载体转化至E.coli Shuffle T7菌株，扩大培养后，加入IPTG诱导表达，收集纯化抗体蛋白。
[0014]本专利技术还提供一种十足目虹彩病毒1的单域抗体在检测十足目虹彩病毒1中的应用。
[0015]相较于现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0016]1、本专利技术制备了十足目虹彩病毒1的单域抗体，填补了目前缺乏DIV1病毒单克隆抗体的空白；本专利技术通过Western Blot以及质谱分析证实，制备得到的D02和D13单域抗体能够特异性地识别DIV1病毒，两者均特异DIV1病毒的结构蛋白YbiA；采用酶联免疫吸附(ELISA)技术测得D02和D13单域抗体对病毒的检测限分别达到102copies/mL和10copies/mL。
[0017]2、本专利技术将制得的十足目虹彩病毒1的单域抗体应用于DIV1病原的早期快速检测中，为建立DIV1病原的单克隆抗体诊断方法，研究虹彩病毒病的发病机理、感染途径和流行规律，以及阻断病毒入侵、实现预防控制虾类虹彩病毒病奠定了坚实的基础。
附图说明
[0018]图1为根据本专利技术方法制备的单域抗体的SDS
‑
PAGE凝胶电泳结果示意图；
[0019]图2为利用Western Blot检测单域抗体对DIV1病毒的特异性识别结果示意图；
[0020]图3为根据利用ELISA检测单域抗体对DIV1病毒检测灵敏度结果示意图。
具体实施方式
[0021]为了使本专利技术所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式和附图对本专利技术所述的技术方案做进一步的说明，但是本专利技术不仅限于此。
[0022]实施例1
[0023]一种十足目虹彩病毒1的单域抗体的制备方法，具体包括以下步骤：
[0024](1)以成年健康的条纹斑竹鲨作为免疫对象，以纯化的DIV1为抗原进行免疫，按照5x106copies/kg的剂量，进行皮下多点注射，共进行免疫6次，相邻两次免疫的时间间隔为14天；
[0025](2)完成免疫后，分离免疫鲨鱼外周血淋巴细胞，采用QIAGEN公司的RNA抽提试剂盒提取总RNA，采用TAKARA公司的PrimeScript
TM
II 1st Strand cDNA Synthesis Kit将RNA逆转录为cDNA；利用我们设计的条纹斑竹鲨vNAR基因扩增特异引物，其中；
[0026]上游引物：CGTGGCCCAGGCGGCCGGGCCCCCTGGTTACCAAATGT；
[0027]下游引物：CGTGGCCCAGGCGGCCGGGCCCTTTGCCAGGTTTCACAGTCAG；
[0028]以获取的cDNA为模板扩增获得vNAR基因片段，将纯化后获得的vNAR基因片段与噬菌粒载体pComb3XSS分别用Sfi I限制性内切酶进行酶切后进行连接，构建重组噬菌粒载体；将构建好的重组噬菌粒载体通过电转化的方式本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种十足目虹彩病毒1的单域抗体，其特征在于：所述单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。2.根据权利要求1所述的单域抗体，其特征在于：所述单域抗体的基因序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。3.一种如权利要求2所述的十足目虹彩病毒1的单域抗体的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)以成年健康的条纹斑竹鲨作为免疫对象，采用DIV1为抗原进行免疫；(2)完成免疫后，分离免疫鲨鱼外周血淋巴细胞，提取总RNA，反转录为cDNA；以cDNA为模板，扩增条纹斑竹鲨vNAR片段，将vNAR基因片段...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈锦霖，郑秦，陈建明，张倩，王蔚，
申请(专利权)人：闽江学院，
类型：发明
国别省市：