一种室温条件下具有扩增活性的DNA聚合酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种室温条件下具有扩增活性的DNA聚合酶及其应用。DNA聚合酶即氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质IME199DNAP。蛋白质IME199DNAP可以在室温(20℃

【技术实现步骤摘要】
一种室温条件下具有扩增活性的DNA聚合酶及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种室温条件下具有扩增活性的DNA聚合酶及其应用。

技术介绍

[0002]聚合酶链式反应(PCR)技术问世以来，对整个生命科学的发展产生了深远影响，成为人们在体外获得目标基因的最常用的方法之一，已在各个领域得到了应用。但是，使用PCR技术扩增时，除了DNA聚合酶外，还必须配备大型且昂贵的热循环仪，这极大地限制了PCR技术在资源受限的环境中以及临时医疗检测分析中的应用。而与需要复杂的热循环仪介导变性、退火和延伸的PCR技术相比，等温扩增技术可以在室温或简单条件(例如水浴)下即可实现快速有效的扩增，其已成为一种有前途替代PCR技术的方法。
[0003]等温扩增技术是体外扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加恒温扩增酶和特异性引物来达到快速核酸扩增的目的。目前已应用的恒温扩增酶(如Bst聚合酶、phi29聚合酶)不仅需要进口，而且价格昂贵，极大的限制了应用。因此，开发新的恒温扩增酶具有重要价值。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的为提供新的DNA聚合酶。
[0005]本专利技术首先保护蛋白质IME199DNAP，其为C1)
‑
C4)中任一种：
[0006]C1)氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质；
[0007]C2)在C1)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
[0008]C3)将C1)或C2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有DNA聚合酶活性、3
’→5’
核酸外切酶活性、链置换活性和/或引物酶活性的蛋白质；
[0009]C4)与将C1)或C2)所示的蛋白质的氨基酸序列具有80％或80％以上同源性且具有DNA聚合酶活性、3
’→5’
核酸外切酶活性、链置换活性和/或引物酶活性的蛋白质。
[0010]其中，SEQ ID NO:2由779个氨基酸残基组成。
[0011]为了使C1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO:2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0012]表1.标签的序列
[0013][0014][0015]上述C3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0016]上述C3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0017]上述C3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO:1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5
′
端和/或3
′
端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0018]本专利技术还保护编码上述任一所述蛋白质IME199DNAP的核酸分子。
[0019]所述编码上述任一所述蛋白质IME199DNAP的核酸分子可为如下e1)或e2)或e3)所示的DNA分子：
[0020]e1)核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；
[0021]e2)与e1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质IME199DNAP的DNA分子；
[0022]e3)在严格条件下与e1)或e2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质IME199DNAP的DNA分子。
[0023]其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0024]其中，SEQ ID NO:1由2340个核苷酸组成，SEQ ID NO:1的核苷酸编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
[0025]本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本专利技术的编码上述任一所述蛋白质IME199DNAP的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本专利技术分离得到的上述任一所述蛋白质IME199DNAP的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述任一所述蛋白质IME199DNAP，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。
[0026]这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质IME199DNAP的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0027]含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物也属于本专利技术的保护范围。
[0028]所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体可为在表达载体的多克隆位点插入SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1自5
’
末端起第1至2337位(即去掉了终止子)所示的DNA分子，得
到的重组质粒。
[0029]所述重组载体具体可为重组质粒pET28a
‑
IME199DNAP。重组质粒pET28a
‑
IME199DNAP可为将pET28a质粒的限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ之间的DNA小片段替换为SEQ ID NO：1自5
’
末端起第1至2337位所示的DNA分子(即去掉了终止子)，得到的重组质粒。
[0030]所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物可为将含有上述任一所述核酸分子的重组载体导入出发微生物得到的重组菌。
[0031]所述出发微生物可为大肠杆菌。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。
[0032]所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物具体可为重组大肠杆菌。所述重组大肠杆菌可为将重组质粒pET28a
‑
IME199DNAP转化导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌。
[0033]本专利技术还保护上述任一所述蛋白质IME199DNAP、上述任一所述核酸分子或含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物在制备DNA聚合酶或作为DNA聚合酶中的应用。
[0034]温度和pH值均对上述任一所述蛋白质IME199DNAP的DNA聚合酶活性具有重要影响。蛋白质IME199DNAP在温度为20
‑
30℃(如20℃或30℃)的范围内均具有良好的DNA聚合酶活性。蛋白质IME199DNAP在pH值为pH3.5
‑
9.5(如pH3.5、pH4.5、pH5.5、pH6.5、pH7.5、pH8.5或pH9.5)的范围内均具有良好的DNA聚合酶活性。
[0035本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.蛋白质IME199DNAP，为C1)
‑
C4)中任一种：C1)氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质；C2)在C1)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；C3)将C1)或C2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有DNA聚合酶活性、3
’→5’
核酸外切酶活性、链置换活性和/或引物酶活性的蛋白质；C4)与将C1)或C2)所示的蛋白质的氨基酸序列具有80％或80％以上同源性且具有DNA聚合酶活性、3
’→5’
核酸外切酶活性、链置换活性和/或引物酶活性的蛋白质。2.编码权利要求1所述蛋白质IME199DNAP的核酸分子。3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下e1)或e2)或e3)所示的DNA分子：e1)核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；e2)与e1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质IME199DNAP的DNA分子；e3)在严格条件下与e1)或...

【专利技术属性】
技术研发人员：童贻刚，韩鹏军，范华昊，宋立华，安小平，李梦哲，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：